哮喘豚鼠肺组织嗜酸性粒细胞Fas表达及药物的影响
第三军医大学学报1999年第21卷第5期
李志奎 王长征 钱桂生
提 要 目的：研究哮喘时嗜酸性粒细胞(Eos)凋亡与Fas表达的关系及药物对它们的影响。方法：应用地塞米松(DM)、雷公藤甲素(Triptolide,TP)及氨茶碱(AM)干预哮喘豚鼠，以TUNEL法检测细胞凋亡，以RT-PCR及原位杂交检测Fas mRNA表达。结果：哮喘组Eos凋亡率较正常对照组显著降低(P＜0.01)，应用DM、TP、AM后均显著增加(P＜0.01)。正常豚鼠Eos可检测到Fas mRNA表达，不同密度Eos表达差异不显著(P＞0.05)。哮喘组Fas mRNA明显减少，以低密度Eos减少明显(P＜0.05)，应用DM、TP、AM后其表达明显增加。结论：凋亡调节的缺失是导致组织及血中Eos增多的重要原因，Fas抗原参与了哮喘Eos凋亡的调节，低密度Eos更能反映哮喘的特征。DM、TP、AM可促进哮喘肺组织中的Eos表达Fas抗原，进而加强细胞凋亡。
关键词：哮喘 嗜酸细胞 细胞凋亡 Fas
哮喘是一非特异的慢性炎症性疾病，嗜酸性粒细胞(Eosinophils,Eos)聚集、活化及其高毒性阳离子蛋白的释放在其发病过程中发挥着重要作用。以往人们注意到Eos的渗出依赖IL-5，但对Eos炎症反应的控制研究很少。不断有证据表明细胞死亡是由细胞凋亡引起，对炎症反应清除很重要。近来发现Eos凋亡减少是哮喘Eos增加的重要原因之一。在体外，Eos存活依赖抑制凋亡的细胞因子白介素(Interleukin,IL)-3、IL-5、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)，是否存在促进Eos凋亡的因素仍不很清。细胞表面分子Fas/apo-1(CD95)被认为是一促凋亡基因，能促进多种细胞凋亡。Fas是一45×103u蛋白，属于TNF/NGF受体家族成员。Fas受体与其单抗或其配体交叉连接可致淋巴细胞凋亡。本实验用地塞米松、雷公藤甲素及氨茶碱干预，观察哮喘肺组织Eos fas表达与细胞凋亡及细胞凋亡与炎症清除的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD)，购自德国Boehringer mannheim (BM)公司。总RNA提取试剂盒(Tripure Isolation Regent)，德国BM公司。寡核苷酸探针3′末端标记试剂盒(Dig oligonucleotide 3′-end Labeling Kit)，德国BM公司 。Percoll分离液，瑞典Phamacia公司。M-MLV逆转转录酶，美国Promega公司。Taq dNA多聚酶，加拿大Sango公司。Oligo dT(15)，美国Promega公司。dNTP，德国BM公司。抗地高辛(Dig)抗体，德国BM公司。
1.2 动物分组
健康豚鼠30只,购自第三军医大学实验动物中心，体重200～250 g，雌雄不拘，随机分为5组(每组6只)：正常对照组、哮喘组、地塞米松(DM)组、雷公藤甲素(Triptolide,TP)组及氨茶碱(AM)组。哮喘动物模型制备参照王长征［1］略加修改。在第1天和第8天，将2%卵蛋白(OA，溶于生理盐水)与等量的氢氧化铝凝胶混匀后，豚鼠腹腔内注入0.5ml。在第21天，将豚鼠置密闭容器内，2%OA气雾进行激发，把动物暴露在OA中至哮喘发作30min为止。激发前30min给予腹腔注射苯海拉明5mg/kg，防止豚鼠严重哮喘发作而死亡。48h后行支气管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage,BAL)。正常组：按哮喘组方法，用苯海拉明预处理动物后，用生理盐水代替2%OA进行激发，48h后行BAL。各处理组：按哮喘组方法处理动物。用卵蛋白激发24h后，用地塞米松10mg/kg或雷公藤甲素40μg/kg或氨茶碱100mg/kg豚鼠腹腔注射，24h后行BAL。
1.3 主要方法
1.3.1支气管肺泡灌洗 经颈动脉放血处死动物后，立即用Hanks液经气管注入5ml×3次，轻轻按摩动物的胸部20～30s后回收BAL，回收率大于90%。
1.3.2 细胞计数及分类 全部BAL液400×g，4℃离心10min，收集沉淀的细胞，重悬于Hanks液中。进行Eos绝对计数。取数滴BAL液至玻片上，行细胞分类。
1.3.3 嗜酸细胞分离 配制不同比重的Percoll液。在5ml离心管中依次加入1.105、1.090、1.080的Percoll液各1ml，最后加入上述细胞悬液1ml。用960×g20℃离心15min。离心完毕后，分别回收不同比重交界面的细胞层。用嗜酸细胞稀释液计不同比重的嗜酸细胞绝对数。调整细胞数5×106/ml，取1ml行RT-PCR。少许细胞涂片行原位杂交及凋亡检测。
1.3.4 引物合成 由中国科学院上海细胞生物研究所合成，PAGE纯化，纯度＞99%。扩增产物长度分别为328、587bp。
Fas：同义链：5′-CAA GGG ACT GAT AGC ATC TTT GAG G-3′
反义链：5′-TGT GAA AGT CCA GAA CCC TAA GG-3′
β-actin：同义链：5′-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3′
反义链：5′-AGG GTA CAT GTG GTG CCG CCA GA-3′
1.3.5 寡核苷酸探针标记 探针应用Fas引物反义链，地高辛(Dig)标记使用3′末端转移法，其原理是利用3′末端转移酶将带有Dig基团的ddUTP掺入寡核苷酸探针3′末端的游离羟基上。操作方法参照试剂盒说明进行，主要步骤如下：取EP管依次加入探针100pmol、标记缓冲液4μl、CoCl24μl、Dig-ddUTP 1μl、TdT 1μl、ddH2O 5μl，37℃孵育10min，4℃过夜。加2μl糖原终止反应。以2.5μl4mol/L LiCl及75μl预冷的乙醇充分混匀，-20℃2h。12000×g离心10min，弃上清，70%乙醇50μl漂洗，空干，加双蒸水20μl，-20℃保存。标记效率大于90%。
1.3.6 原位凋亡细胞检测 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法。参照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察摄影。
1.3.7 原位杂交 参照蔡文琴［2］的方法进行。
1.3.8 逆转录PCR法
1.3.8.1 总RNA提取 应用Tripure提取药盒(Tripure isolation reagent,TIR)依说明书进行。选取5×106细胞悬液提取RNA，细胞入EP管离心、弃上清。室温直接加TIR：1ml对(5～10)×106，吹打、混匀以溶解上述样品。在室温放5 min以确保完全溶解。加0.2ml氯仿。混匀15s，室温2～15min。12000×g4℃离心15min。将无色上清转入新EP管。加0.5ml异丙醇。充分混匀，室温5～10min，沉淀RNA。12000×g4℃离心10min。弃上清。加1ml(4℃预冷)75%乙醇。洗RNA-重悬混匀。7500×g4℃离心5min。弃上清后空气干燥。用DEPC水20μl重悬RNA。吹吸几次溶液以助溶解，55℃～60℃温育10～15min。测量D260、D280。所有样本D260/D280＞1.8,以D260计算RNA量，用2μgRNA进行cDNA合成。
1.3.8.2 逆转录应用MMLV，引物应用Oligo(dT)15，逆转录为42℃90min。
1.3.8.3 PCR反应条件 96℃6min。冰浴后加Taq酶(2.5 u)0.7μl，94℃45s，55℃45s，72℃1min。35个循环，72℃10min。PCR产物检测：采用1.5%琼脂糖凝胶，加10μl fas及相应的β-actin PCR产物进行电泳，电压5～10V/cm2，电泳40min，于紫外透射仪下观察并拍照。电泳图扫描后用PHOTSHOP进行分析。以积分光密度(IOD)(Fas)/IOD(βactin)之比进行统计学分析。
1.4 统计学分析
所有数据以SPSS(Statistics package for social science)统计学分析。各组结果以X±s表示，采用非配对t检验。
2 结果
2.1 DM、TP、AM对哮喘豚鼠Eos细胞凋亡的影响
哮喘组Eos凋亡率较正常对照组明显降低(P＜0.01)，应用DM、TP、AM后均显著增加(P＜0.05)，低密度Eos与正常密度Eos比较差异不显著(P＞0.05)，见表1。
表 1 DM、TP、AM对哮喘豚鼠BALF中Eos细胞凋亡的作用(%，n=6，X±s)
tab 1 Effects of DM,TP and AM on the apoptosis of eosinophils in BALF of asthmatic guinea pig(%，n=6，X±s)
| |
Normal |
Asthma |
Dexamethasone |
Triptolide |
Aminophylline |
| Hypodensity Eos |
8±2 |
4±2## |
24±5** |
17±9* |
15±5** |
| Normal density Eos |
7±2 |
3±2## |
22±4** |
16±8* |
14±4** |
##：P＜0.01 vs normal；*：P＜0.05,**：P＜0.01 vs asthma
2.2 DM、TP、AM对哮喘豚鼠肺组织及BALF eos Fas表达的影响
原位杂交显示：正常组可检测到Fas mRNA表达，哮喘组明显减少(P＜0.05),以低密度Eos明显(P＜0.05)，应用DM、TP后其表达明显增加(P＜0.05，P＜0.01)。AM可使低密度Eos fas表达增强(P＜0.05)，对正常密度Eos Fas表达无显著影响(P＞0.05)，见表2。
2.3 DM、TP、AM对Eos Fas mRNA表达相对含量的影响
RT-PCR检测显示：正常组Eos可检测到Fas mRNA表达，哮喘组明显减少(P＜0.05)，应用DM、TP、AM后其表达明显增加，以低密度Eos明显。AM组低密度Eos fas表达增强(P＜0.05)，正常密度Eos Fas表达增加不明显(P＞0.05)，见表3。
表 2 DM、TP、AM对哮喘豚鼠肺BALF eos Fas mRNA表达的影响［原位杂交强阳性率(%)，n=6，X±s］
tab 2 Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils of asthmatic guinea pig BALF(%，n=6，X±s)
| |
Normal |
Asthma |
Dexamethasone |
Triptolide |
Aminophylline |
| Hypodensity Eos |
35±8 |
25±3# |
37±5** |
36±9* |
36±8* |
| Normal density Eos |
43±6 |
33±7# |
43±6* |
43±8* |
37±17 |
#：P＜0.05 vs normal;*：P＜0.05，**：P＜0.01 vs asthma
表 3 DM、TP、AM对Eos Fas mRNA表达相对含量的影响(IOD(Fas)/IOD(βactin),n=6,X±s)
tab 3 Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils of asthmatic guinea pig BALF(IOD(Fas)/IOD(βactin)，n=6,X±s)
| |
Normal |
Asthma |
Dexamethasone |
Triptolide |
Aminophyline |
| Hypodensity Eos |
2.09±0.14 |
1.25±0.11## |
1.89±0.20** |
1.69±0.21** |
1.63±0.24** |
| Normal density Eos |
1.91±0.45 |
1.29±0.19# |
1.89±0.24** |
1.64±0.21* |
1.60±0.39 |
#：P＜0.05, ##：P＜0.01 vs normal;*：P＜0.05，**：P＜0.01 vs asthma
3 讨论
嗜酸性粒细胞在血中聚集及活化是许多过敏疾病的特征。活化的Eos细胞毒产物引起的细胞损伤，致组织炎症，炎症的清除一部分是通过巨噬细胞，它可完整吞噬凋亡细胞。炎症细胞活动则通过选择性加强它们自我损伤而加速在组织中的清除。最近Fas抗原研究给控制凋亡复杂网络带来一些希望。在多种细胞类型中起凋亡作用Fas(Apo-1/CD95)，是一种45×103u的跨膜蛋白，与TNF-α、CD40等同属肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族。Fas可在胸腺细胞、T细胞、单核细胞、B细胞、质化细胞、上皮细胞及内皮细胞等多种细胞中表达。Fas抗原与它的天然配体(FasL)或其抗体结合后，诱导细胞内的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化以及引起细胞内Ca2+浓度升高，促进细胞凋亡。这是一种Fas依赖的清除体内多余细胞的重要方式。在体外，Fas配体及特异的单抗可致许多类型的细胞凋亡。最近发现Eos可表达低但恒定的Fas抗原水平。抗Fas单抗在体外应用可加速Eos凋亡，在体内可通过降低组织Eos炎症治疗鼻息肉［3］。本研究发现，正常豚鼠的Eos存在一?康腇as mRNA表达，而在哮喘时Eos表达Fas明显下降，同时细胞凋亡减少，表明Fas依赖的Eos凋亡是哮喘Eos的特征。不同密度的Eos细胞活性不同，低密度Eos具有高细胞活性，本研究结果显示正常豚鼠肺中不同密度Eos fas表达无差异，而哮喘组低密度Eos较正常密度Eos Fas表达明显下降，表明它是哮喘组织炎症产生的主要原因，其调节凋亡的Fas通路在哮喘时受限更加明显，同时对各种药物反应也更敏感。是Eos炎症及其清除的焦点。有研究表明抗Fas抗体在24 h内几乎可完全缓解Eos肺炎［4］。凋亡细胞很快被巨噬细胞吞噬，并不引起第二次炎症，更重要的是Fas介导的细胞死亡不能被外加IL-3、IL-5或GM-CSF救活。表明：①Fas介导死亡不易被这类因子通过bcl-2信号救活，②在严重的激素不敏感哮喘时，这些因子逃避了抑制，针对Fas的治疗也许很有用。缺乏Fas介导的Eos死亡可能是哮喘时慢性气道炎症的重要因素［4，5］。
糖皮质激素通过不同机制抑制炎症细胞中细胞因子基因转录来降低组织中的炎症，在治疗多种Eos相关疾病包括哮喘中有显著作用。地塞米松能引起体内Eos显著降低。虽然激素作用的确切机理仍需研究，体内外实验均表明激素可促进凋亡的产生，本研究也证明了这一点。地塞米松结合Eos上的糖皮质激素受体，相互作用，加速凋亡，促进炎症的清除［6］。Wallen等［7］发现IL-5、IL-3及GM-CSF介导的Eos存活可被皮质激素阻止。表明激素竞争性阻滞Eos活动性细胞因子的作用。激素调整Eos的死亡通过影响不同的凋亡信号，包括Fas抗原的活动［8］。本研究发现哮喘豚鼠Eos fas抗原表达下降，应用DM、TP、AM后，其Fas抗原表达增加，表明它们均可影响了Fas/FasL通路，促进细胞凋亡，利于肺组织炎症的清除，以DM明显。AM也促进了Eos凋亡，与地塞米松组无明显差异，但对Eos fas的表达不如DM及TP强，表明其作用机制不完全一样。其详细机制有待进一步研究。
凋亡调节的缺失是导致组织及血中Eos增多的重要原因，Fas抗原也参与了哮喘豚鼠Eos凋亡的调节，DM、TP、AM可促进哮喘肺组织中的Eos表达Fas抗原，进而加强细胞凋亡。发现选择性的促进Fas表达过程的制剂对清除炎症及过敏反应具有诱人的前景。
国家自然科学基金资助项目，No.39670337
作者简介：李志奎，男，36岁，副主任医师，博士研究生
作者单位：第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
参考文献
1 王长征，王春霞，钱桂生，等.银杏苦内酯对过敏性豚鼠气道内低密度嗜酸性细胞增多的调节作用.中国药理学通报，1996，12(3)：238
2 蔡文琴，王伯沄主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.406～409
3 Hebestreit h, Yousefi S, Batti I, et al. Expression and function of the Fas receptor on human blood and tissue eosinophils. Eur J Immunol,1996,26(8):1775
4 Tsuyuki s, Bertrand C, Erard F, et al. Activation of the Fas receptor on lung eosinophils leads to apoptosis and the resolution of eosinophilic inflammation of the airways. J Clin Invest,1995,96(6):2924
5 Anderson g P. Resolution of chronic inflammation by therapeutic induction of apoptosis. tIPS,1996,17(12):438
6 Woolley k L, Gibson P G, Carty K, et al. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med,1996,154(1):237
7 Wallen n, Kita H, Weiter D, et al. Glucocorticoids inhibit cytokine-mediated eosinophil survival. J Immunol,1991,147(10):3490
8 Druilhe a, Cai Z, Haile S, et al. Fas-mediated apoptosis in cultured human eosinophils. blood,1996,87(7):2822
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