β₂受体激动剂对哮喘豚鼠糖皮质激素受体功能影响的研究

中华结核和呼吸感染 2000年第8期第23卷 论著摘要

作者：黄茂　戴山林　王虹　杨玉　邹洪波　郑仕中　周大虎

单位：黄茂 戴山林 王虹 杨玉（210029 南京，南京医科大学第一附属医院呼吸科）；邹洪波 郑仕中 周大虎（南京医科大学基础同位素研究室）

　　糖皮质激素(GC)和支气管舒张药β₂受体激动剂 (β₂ AA)，临床上常被联合用于治疗支气管哮喘。近年来，有人认为长期规则使用β₂ AA 可使哮喘病情恶化和增加病死率^［1］。 我们的研究旨在从分子水平探索β₂ AA沙丁胺醇对哮喘豚鼠血淋巴细胞糖皮质激素受体(GR)功能的影响，为临床合理应用β₂ AA和GC提供重要的实验依据。

　　材料与方法　哮喘动物模型的复制及分组：50只豚鼠，雄性，体重450～550 g，参照国内、外常用的方法复制哮喘模型。哮喘豚鼠随机分为对照组（A组，10只)；沙丁胺醇组（B组，10只)：每次予沙丁胺醇(重庆葛兰素)0.2 mg/kg，肌肉注射，每日3次，连续14 d；地塞米松组(C组10只)：每次予地塞米松(南京第三制药厂)0.5 mg/kg，肌肉注射，每日2次，连续14 d；沙丁胺醇+地塞米松组(D组，20只)：每次同时予沙丁胺醇0.2 mg/kg， 每日3次，及地塞米松0.5 mg/kg， 每日2次，肌肉注射，其中随机分为D1组(10只，用药3 d)，D2组(5只，用药7 d)，D3组(5只，用药14 d)。

　　哮喘豚鼠血淋巴细胞的制备：将哮喘豚鼠麻醉后经颈动脉放尽血液，肝素抗凝。加Ficoll-泛影葡胺淋巴细胞分离液(比重1.085 kg/L )，离心后收集淋巴细胞。用放射性配基结合分析法测定哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd(亲和力)及Bmax(最大受体结合容量)值：将淋巴细胞调成1.5×10⁶个细胞/ml的浓度，取1 ml悬液加入³H地塞注米松，相应浓度为2、4、8、12、20 nmol。经处理后加8 ml闪烁液进行液闪计数。采用Scatchard 标准作图法计算出Bmax及Kd值。采用凝胶阻滞分析法(EMSA)检测GR与GRE(糖皮质类固醇反应片段)结合能力：参照Dignam^［2］标准方法提取淋巴细胞核蛋白。将经过提纯的包含特异性 GRE的dsDNA(双链DNA)，序列为5′CCATATGCAGCCACTGTTCTTAGCGGGTTT3′，参照Peters^［3］方法，用［γ-³²P］ATP标记dsDNA探针，并进行EMSA，用光密度扫描仪读取特异性漂移条带的密度，以相关密度单位(RDU)表示。

　　统计学处理：实验数据以±s表示，采用t检验处理数据。

　　结果　各组哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd和Bmax及GR与GRE结合条带密度见表1。

　　结果表明，各组GR的Kd值差异无显著性(P＞0.05)；对照组与沙丁胺醇组GR的Bmax比较差异无显著性(P＞0.05)；地塞米松组GR Bmax、沙丁胺醇+地塞米松组与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)；沙丁胺醇组淋巴细胞GR与GRE结合条带密度值与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)，地塞米松组与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)；沙丁胺醇+地塞米松组(7 d组及14 d组)淋巴细胞GR与GRE结合条带密度值均与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)，且具有时间依赖性。

表1　各组哮喘豚鼠血淋巴细胞GR的Kd和Bmax及

　　GR与GRE结合条带密度(±s)

　　注：与A组比较^* P＞0.05；^**P＜0.01

　　讨论　本组研究结果表明，使用β₂ AA对淋巴细胞GR的Kd及Bmax没有影响，而沙丁胺醇组GR与GRE的结合值约为对照组的17%，严重影响GR与GRE的结合，对GR与GRE的亲和力没有影响^［4］。目前认为，β₂ AA致GR与GRE下降的机制是其与受体结合后激活细胞膜内侧腺苷酸环化酶(AC)，使cAMP含量增加，继而激活cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)发挥作用，激活cAMP应答成份结合蛋白(CREB)并形成CREB-GR复合物，减少GR与GRE的结合，抑制内、外源性GC的抗炎作用。Adcock等^［5］报道，β₂受体激动剂使cAMP含量增加，活化CREB， 继使活化蛋白1（AP-1)或核因子-κB （NF-κB)激活，后者与GR结合形成复合物，导致GR有效数量进一步减少，GC效应减弱。

　　本组研究结果显示，当沙丁胺醇与地塞米松合用3 d时，可使GR-GRE 结合值较对照组下降，7 d时明显下降，14 d时仅为对照组的25%，但高于沙丁胺醇组，远低于地塞米松组。该结果进一步揭示β₂ AA对GR-GRE结合数量的影响， 即同时合用地塞米松时，GR-GRE的结合值仍然是低下的，且随着时间的延长，GR-GRE的结合值越低，具有时间依赖性。临床研究发现，GC治疗3周将阻断气道对吸入抗原的反应， 如联合吸入相对大剂量的β₂ AA，则丧失GC对气道的保护作用，减少β₂ AA吸入量可恢复气道对GC的反应^［6］。对一组GC严重依赖的哮喘患者研究亦发现，逐渐撤除β₂ AA的吸入可减少口服泼尼松的需要量^［7］。因此，对哮喘患者，尤其是慢性哮喘患者，应以 GC有效控制炎症反应为主，而β₂ AA应短期使用为宜。

参考文献

　　［1］Suissa SP，Ernst JF，Boivan RI ， et al. A cohort analysis of excess mortality in asthma and the use of inhaled beta-agonists. Am Rev Respir Dis，1994，149:604-610.

　　［2］Dignam JD，Lebovitz RM，Roceder RG.Accurate transcription initiation by RNA polymeraseⅡin a soluble from isolated mammalian nuclei.Nucleic Acids Res，1983，11:1475-1489.

　　［3］Peters MJ，Adcock IM，Brown CR.β-Adrenoceptor agonists interfere with glucocorticoid receptor DNA binding in rat lung. European Journal of Pharmacology，1995，289:275-281.

　　［4］Adcock IM， Lane SJ， Brown CR， et al. Differences in binding of glucocorticoid receptor to DNA in steroid-resistant asthma. J Immunol，1995，154:3500-3505.

　　［5］Adcock IM，Stevens DA，Barnes PJ. Interactions of glucocorticoids and β₂-agonists.Eur Respir J，1996，9:160-168.

　　［6］Wong CS, Wahednal I, Pavord ID, et al. Effects of regular terbutaline and budesonide on bronchial reactivity to allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 150:1268-1278.

　　［7］Barnes PJ, Adcock IM. Anti-inflammatory actions of steroids: molecular mechanisms. Trends Pharmacol Sci, 1993, 14:436-441.

(收稿日期：1999-08-11)