哮喘豚鼠肺组织白细胞介素5 mRNA表达等研究

中华结核和呼吸感染 1998年第11期第0卷 论著摘要

作者：毕玉田　杨肇亨

单位：400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸科

　　采用卵蛋白(OA)吸入诱发豚鼠哮喘模型，分析支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞(EOS)细胞数目改变，检测不同密度EOS数目及比例改变，并采用原位杂交技术检测肺组织白细胞介素5(IL-5) mRNA表达，以及地塞米松对其表达的影响。

　　方法　36只豚鼠雌雄不限，体重300～400 g，随机分为正常对照组、哮喘组、地塞米松治疗组。(1)哮喘组(8只)：参照Hustson方法^[1]复制哮喘模型，诱发后24小时采集标本。(2)对照组(7只)：用生理盐水替代OA致敏；(3)地塞米松组(8只)：致敏同哮喘组，在第16天用0.5 mg·kg^-1·d^-1地塞米松腹腔注射，连续6天，诱发前12小时停药。肺组织原位杂交标本按文献［2］制作。常规方法收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。①EOS的分离：制成密度为1.090 kg/L和1.080 kg/L的Percoll液，各2 ml先后加入试管中，沿管壁加BALF于其上，2 000 r/min离心20分钟，分别收集第一层、中间层及沉淀细胞行EOS计数。②探针的制备及标记：按常规行鼠IL-5 cDNA质粒pSP6k-mTRF23（本校王长征博士惠赠）的转化、扩增、抽提和纯化，Bam H_I酶切、目的片段回收，片段约1.5kb。按德国宝灵曼公司试剂盒说明，用地高辛配基随机引物法标记IL-5 cDNA探

　　针^［3］。原位杂交参照文献［2］进行，略有改进。③阴性对照：肺组织切片预先经RNA酶处理后再行原位杂交。(4)图像分析：每一玻片任选5个视野，自动检测阳性细胞面密度，取其平均值进行统计分析。

　　统计学处理采用非配对资料t检验和直线相关分析。

　　结果　BALF中的细胞按不同比重分为3层，第1层细胞比重为1.080kg/L以下，第2层细胞比重在1.080～1.090 kg/L之间，第3层细胞比重＞1.090 kg/L。正常组EOS主要分布于第2、3层，第1层仍可见少许EOS。哮喘组各层中EOS计数分别为(1.880±0.331)×10⁸/L、(1.217±0.299)×10⁸/L、(3.015±0.445)×10⁸/L，均显著高于对照组及地塞米松组，特别是在第1层细胞中EOS占EOS总数的30%(P＜0.01)。地塞米松组较对照组各层的细胞数目显著增高，但与哮喘组相比明显减少(P＜0.01)。定第1、2层EOS为低密度EOS(HEo)，第三层EOS为正常密度的EOS(NEo)。哮喘组HEo%增加特别明显(P＜0.01)，而经地塞米松处理后HEo%明显下降，但仍高于正常组。IL-5原位杂交显示，哮喘时肺组织较广泛阳性染色细胞，主要分布于气管粘膜下、肺泡间、甚至肺泡腔内，IL-5 mRNA水平(27±14，面密度10^-3)明显高于对照组和地塞米松组(P＜0.01)。地塞米松组IL-5 mRNA水平与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。IL-5 mRNA水平与EOS总数(r=0.688,P＜0.01)及HEo%(r=0.582, P＜0.01)呈非常显著正相关。

图1　哮喘豚鼠肺组织IL-5 mRNA　原位杂交　×100

图2　哮喘豚鼠肺组织IL-5 mRNA染色阳性，IL-5 mRNA定位于胞浆，呈紫蓝色，阳性细胞主要分布于支气管粘膜下、肺泡间，甚至肺泡腔内　原位杂交　×400

　　讨论　本组实验证实，哮喘豚鼠肺组织IL-5 mRNA表达水平增高。已知IL-5为EOS分化、发育及功能调节的重要分子，IL-5过度表达与EOS增多相关^［3］。在体外NEo与IL-5共育后变为HEo，并可自发地分泌其中的多种碱性蛋白^［4］。本组实验在诱发哮喘24小时后收集BALF，可见EOS总数及HEo均较正常组显著升高，表明哮喘时活化的EOS增多。而EOS特别是HEo升高与肺组织IL-5 mRNA水平增加密切相关。肺组织IL-5可能通过直接或间接趋化、粘附作用募集EOS到达肺组织局部^［5］。肺组织局部高浓度IL-5进一步活化EOS，促进炎性介质释放而造成损伤效应及气道高反应性。地塞米松组肺组织IL-5 mRNA水平较哮喘组显著降低，与对照组比较差异无显著性，表明地塞米松对IL-5 mRNA表达的抑制作用极为明显，并与哮喘症状减轻相一致。地塞米松组BALF不同密度EOS均较哮喘组下降，特别是第1层EOS下降最为明显，几乎降至正常对照组水平，推测地塞米松通过下调IL-5而抑制EOS。其机制可能在于肺组织局部IL-5水平下降，使外周血EOS在组织局部的聚集减少^［6］，因此表现为地塞米松组BALF中EOS总数下降。地塞米松缓解哮喘另一重要原因可能在于通过抑制IL-5，减轻IL-5对EOS的活化作用^［4］，这主要表现为地塞米松组较哮喘组HEo%的明显降低。

参考文献

　　1　Hutson PA,Church MK,Clay TP, et al.Early and late-phase bronchoconstriction after allergen challenge of nonanesthetized guinea pigs I.The association of disordered airway physiology to leukocyte infiltration. Am Rev Respir Dis, 1988,137:548-557.

　　2　蔡文琴,王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 第1版.四川：科学技术出版社,1994.406-434.

　　3　Sanjiv S, Gerald J, Gleich MD, et al. Eosinophilic inflammation is associated with spontaneous symptomatic asthma. J Allergy Clin Immunol, 1995,96:661-668.

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　　5　Schmi R, Wardlaw AJ, Cromwell O, et al. Interleukin-5 selectively enhances the chemotactic response of eosinophils obtained from normal but not eosinophilic subjects. Blood, 1992,79:2952-2959.

　　6　Walsh GM, Hartnell A, Wardlaw AJ, et al. IL-5 enhances the in vitro adhesion of human eosinophils, but not neutrophils, in a leukocyte integrin ()-dependent manner. Immunology, 1990,71:258-265.

(收稿：1998-01-07　　修回：1998-04-09)