一氧化氮及其合酶在哮喘发病机制中的作用

中华结核和呼吸感染 1998年第4期第0卷 论著

作者：蒋东波　李华强　史源　潘捷　沈际皋　姚忠凯　杜文华

单位：400042 重庆 第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所

　　【摘要】　目的　探讨一氧化氮(NO)及其合酶(NOS)在哮喘发病机制中的作用。方法　采用哮喘豚鼠模型，将豚鼠分为4组：(1)哮喘组(13只)，用10%卵白蛋白腹腔注射1 ml致敏，2周后用1%卵白蛋白超声雾化吸入致其哮喘发作。(2)肾上腺皮质激素预防组（激素组13只）；诱喘同哮喘组，在每次诱喘前腹腔滴注地塞米松0.5 mg/kg。(3)硝基精氨酸甲酯预防组(L-NNA组13只)：诱喘同哮喘组，每次诱喘前腹腔注射LNNA 0.4 mg/kg。(4)正常对照组(13只)：用生理盐水代替诱喘剂。每组分别测定其血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织/水平，肺组织诱导型(iNOS)和原生型(cNOS)一氧化氮合酶活性水平，并用组织化学染色法观察了NOS在豚鼠哮喘模型肺组织中的分布。结果　4组豚鼠血浆/水平差异无显著性(P均＞0.05)。哮喘组BALF及肺组织中N/N和肺组织iNOS活性水平均明显高于其它3组(哮喘组BALF中/，t分别=7.37、4.95、4.48，P均＜0.01；哮喘组肺组织中/，t分别=23.34、18.10、16.12，P均＜0.01；哮喘组肺组织iNOS，t分别=7.42、7.51、6.93，P均＜0.01)；但这3组之间差异无显著意义(P均＞0.05)。LNNA组肺组织cNOS活性水平明显低于对照组(t=2.15，P＜0.05)，但与另两组间比较差异无显著性(P均＞0.05)，其余3组比较差异亦无显著性(P均＞0.05)。而且哮喘组肺组织iNOS活性水平与BALF和肺组织/水平呈高度正相关(r分别=0.714，0.842，P分别＜0.05，0.01)。对照组肺组织还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(NADPHd)，组织化学方法显示的阳性产物主要分布于各级支气管上皮细胞，哮喘组及激素组阳性产物变化不明显，但是LNNA组可见阳性产物明显减少。结论　哮喘豚鼠肺组织cNOS活性水平变化不明显，而iNOS活性水平升高，导致BALF及肺组织中/水平随之升高，从而使气道粘膜水肿，加重气道阻塞，并损伤气道组织，加重炎症反应，引起气道高反应性而导致和(或)加重哮喘发病。

　　【关键词】　哮喘　　一氧化氮　　一氧化氮合酶

The role of nitric oxide and nitric oxide synthase in the pathogenesis of asthma

Jiang Dongbo, Li Huaqiang, Shi Yuan, et al. Institute of Surgery. Daping Hospital, Third Military Medical College, Chongqing 400042

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) in the pathogenesis of asthma.Method　52 guinea pigs were randomly divided into four groups of 13 each: (1) asthmatic group (Group A): Dunkin-Hartley guinea-pigs were injected celiacly with 1 ml of 10% ovalbumin (OA). After 14 days, the animals were inhaled with an aerosol of 1% OA for 40～60 seconds for 10 days every other day; (2) Corticosteroid prevention group (Group CT): As above, just before the animals were inhaled with an aerosol, 0.5 mg/kg dexamethasone were injected celiacly ; (3) N-nitro-L arginine prevention group (Group L): As Group A, just before the animals were inhaled with an aerosol, 0.4 mg/kg LNNA were injected celiacly; (4) Controls (Group C): and nitrate (/) levels in plasma, nitrite bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissues were examined . At the same time, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and constitute nitric oxide synthase (cNOS) activity levels in the lung tissues were examined, and the changes of cNOS in the guinea pig asthma model lung tissues were observed using histochemical detection. Result　All groups had no significant alteration of / in the plasma (P＞0.05). Group A had increased amounts of / in the BALF and in the lung tissues compared with the other groups (BALF: Group A 10.2±1.3, Group CT 7.2±1.1, Group L 7.3±1.3, Group C 6.2±0.8 μmol/L respectively, all of P＜0.01; the lung tissues: Group A 0.89±0.07, Group CT 0.16±0.09, Group L 0.24±0.09, Group C 0.18±0.05 nmol/mg respectively, all of P＜0.01). Group A also showed increased amounts of iNOS levels in the lung tissues than the other groups (Group A 59±18, Group CT 10±5, Group L 12±7, Group C 10±5 pmol/mg respectively, all of P＜0.01). Group L showed decreased amounts of cNOS levels in the lung tissues than the Group C (0.8±0.4, 1.2±0.4 fmol/mg, P＜0.05). While there were no significant alterations in the other groups (P＞0.05). Elevation of iNOS in the lung tissues was correlated with / in the BALF and in the lung tissues (r=0.714, 0.842, respectively, P＜0.05, 0.01 respectively). NADPHd was found to be a histochemical marker reflecting cNOS activity. It was found that there was no marked alteration of cNOS activity in the Group A, Group CT and Group C, but lower in the Group L. Conclusion　There is increased production of iNOS in asthmatic guinea pigs, the iNOS produced could cause increased production of NO, and probably cause cytotoxicity and mediate airway hyperresponsiveness. NO and NOS may play an important role in the pathogenesis of asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Nitric oxide　　Nitric oxide synthase

　　哮喘是一种气道慢性炎症反应，其特征是气道高反应性(AHR)，炎细胞浸润及细胞因子的增加。近年研究发现内源性一氧化氮(NO)具有广泛的生物学作用，既是细胞信使分子，又是细胞毒性分子^［1］。NO作用的多样性决定了其在哮喘发病机理中的复杂性。因此，NO及其合酶对哮喘发病机制的影响越来越多地受到重视。在体内，一氧化氮合酶(NOS)是催化生成NO的关键酶，NOS分为两种，即诱导型(iNOS)和原生型(cNOS)^［1］。不同的酶产生不同剂量的NO，其作用亦不一致，因此，NO及其合酶在哮喘的发病中可能有重要作用。为此，我们检测了过敏性哮喘豚鼠模型血浆及肺组织NO水平，肺组织iNOS和cNOS活性水平，并用还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶（NADPHd）组织化学染色法观察了NOS在豚鼠哮喘模型肺组织分布情况，以探讨NO及其合酶在哮喘发病机制中的作用。

　　材料与方法

　　1.实验动物: 健康豚鼠52只，体重250±20 g。雌雄各半，随机分为4组，每组13只。

　　(1)哮喘组：动物模型的制作按郭鹞^［2］法并略加改良。用10%卵白蛋白腹腔注射1 ml将动物致敏，2周后用1%卵白蛋白超声雾化吸入致其哮喘发作，所有动物均出现喘息，呼吸困难和青紫等。隔日诱喘1次，共10次，末次后于15分钟内采心脏血标本并处死动物，摘取肺脏，称重肺组织。8只行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液 (BALF) 6～7 ml，置4℃离心后，取上清液待测。然后剪碎肺组织，置10 ml离心管内，按1∶5加入PBS，组织匀浆器匀浆，10 000 r/min离心15分钟，收集上清液待测。5只行NADPHd组织化学染色。(2)肾上腺皮质激素预防组(激素组)：诱喘及操作方法同哮喘组，在每次诱喘前腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg，其哮喘发作稍轻于(1)组。(3)硝基精氨酸甲酯组(LNNA组)：诱喘及操作方法同哮喘组，在每次诱喘前腹腔注射LNNA 0.4 mg/kg，其哮喘发作同(1)组相似。(4)正常对照组：用生理盐水代替诱喘剂，其余操作同哮喘组。

　　2.方法：(1)血浆及肺组织NO水平测定：用镉还原柱层析及比色法，通过检测/浓度以代表NO水平^［3］。(2)肺组织NOS活性水平测定^［4］：由中国协和医科大学提供NOS检测试剂盒。(3)NADPHd组织化学染色^［5］：常规灌注固定及后固定肺组织，30%蔗糖，40℃过夜；冰冻切片；新鲜配制的NADPHd染液(0.1 mol PBS，含β-NADPH 1 mg/ml, NBT 0.25 mg/ml)中染色1小时；裱片，脱水，封片；光镜下观察：NADPHd阳性细胞为蓝色。

　　3. 统计学处理：结果以平均值标准差表示，组间比较用t检验，并做直线相关分析。

　　结果

　　一、过敏性哮喘豚鼠NO2-/NO3-水平、iNOS及cNOS活性水平

　　诱喘后四组豚鼠血浆/水平差异无显著性(P均＞0.05，附表)；哮喘组BALF及肺组织中/和肺组织iNOS活性水平均明显高于其它三组(哮喘组BALF中/，t分别=7.37、4.95、4.48，P均＜0.01; 哮喘组肺组织中/，t分别=23.34、18.10、16.12，P均＜0.01; 哮喘组肺组织iNOS，t分别=7.42、7.51、6.93,P均＜0.01 )；但其它三组之间差异无显著意义(P均＞0.05)。LNNA组肺组织cNOS活性水平明显低于对照组(t=2.15，P＜0.05)，但与另两组间比较差异无显著性(P均＞0.05)，其余三组比较差异亦无显著性(P均＞0.05)。

附表　过敏性哮喘豚鼠/、iNOS及cNOS活性水平(±s)

组别	只数	、			iNOS(pmol/mg)*	cNOS(fmol/mg*)
		血浆(μmol/L)	BALF(μmol/L)	肺组织(nmol/mg*)
对照组	8	22.6±2.7	6.2±0.8	0.18±0.05	10±5	1.2±0.4
哮喘组	8	21.6±2.3	10.2±1.3**△	0.89±0.07**△	59±18**△	1.0±0.4
激素组	8	21.4±2.8	7.2±1.1	0.16±0.09	10±5	1.0±0.4
LNNA组	8	22.3±2.3	7.3±1.3	0.24±0.09	12±7	0.8±0.4▲

　　注：^*为每毫克蛋白；与对照组比较^▲P＜0.05，与对照组比较^**P＜0.01，与激素组和LNNA组比较^△P＜0.01　　而且哮喘组肺组织iNOS活性水平与BALF和肺组织/水平呈高度正相关(r分别=0.714, 0.842,P分别＜0.05, 0.01)。

　　二、NADPHd组织化学染色结果

　　对照组肺组织NADPHd组织化学方法显示的阳性产物呈蓝色沉淀，主要分布于各级支气管上皮细胞，哮喘组及激素组阳性产物变化不明显，但是LNNA组可见阳性产物明显减少(图1～9)。

　　 讨论

　　本组研究发现，哮喘豚鼠血浆/水平无明显变化，而肺组织及BALF中/水平升高，说明NO为局部作用，应用iNOS选择性抑制剂地塞米松和iNOS非选择性抑制剂LNNA均能降低其含量，充分说明/产量增高系由于内源性NO产生过多所致。过敏原及炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α), 白细胞介素1(IL-1), γ干扰素(INF-γ)等诱导气道上皮细胞、巨噬细胞及中性粒细胞等合成iNOS是NO增加的原因之一。NO对气道平滑肌具有直接的舒张作用，气道非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经系统以NO为介质，亦增强支气管扩张，但NO同时扩张支气管粘膜血管，增强毛细血管渗出，导致气道粘膜水肿，加重气道阻塞，NO与O₂反应生成超氧亚硝基阴离子(ONOO)，释放氧自由基，损伤气道组织，加重炎症反应，引起气道高反应性(AHR)而导致和(或)加重哮喘发病^［6］。

　　我们发现哮喘豚鼠肺组织cNOS活性水平变化不明显；而iNOS活性经历了和/含量变化相似的过程，还发现iNOS与BALF和肺组织/水平呈高度正相关，且地塞米松和LNNA均能抑制哮喘豚鼠肺组织iNOS活性升高。提示哮喘时NO水平的升高是由于iNOS被激活，诱导所致。哮喘过程中过敏原及炎性刺激等启动了肺组织细胞内iNOS mRNA的转录， 在胞浆内指导其蛋白质的合成，蛋白质一旦合成便贮于胞浆。哮喘过程中炎性细胞亦产生IL-1, TNF-α, INF-γ等细胞因子，这些细胞因子诱导iNOS表达其活性，致使NO大量释放，发挥组织和细胞毒性作用，致AHR，引起和加重哮喘发病^［6］。因此，选择性抑制iNOS活性是治疗哮喘的一个方向。

　　越来越多的证据表明NO是气道NANC神经的递质。NANC神经系统是人类气道唯一具有扩张支气管作用的神经纤维；而在豚鼠亦发挥近一半的舒张支气管作用。以前人们推测哮喘时NANC神经可能有功能上的缺陷，其本质可能是NO的缺乏，但Barnes等^［7］报道在哮喘患者并未证实有NANC神经功能异常。在本组实验中也未观察到哮喘豚鼠肺组织cNOS活性水平的明显变化。LNNA在抑制iNOS活性的同时也抑制cNOS，故不宜用于哮喘的治疗。

　　Dawson等^［8］证明NADPHd组织化学方法显示的神经，血管等定位与应用抗cNOS多克隆抗体免疫组化显示的cNOS阳性定位是一致的，因此，应用NADPHd组织化学方法来显示该类型NOS已成为一种简便而有效的手段。本组发现NADPHd阳性产物主要分布于豚鼠肺内各级支气管上皮。Furness等^［9］证明cNOS与P物质，VIP共存于同一神经元内。因此，各级支气管上皮细胞存在的NOS主要功能在于调节其舒缩，以维持正常通气。LNNA能使cNOS阳性产物明显减少，这说明该部位阳性显色确系阳性反应所致。

　　综上所述，NO在哮喘发病中具有十分复杂的双重作用。一方面它是支气管扩张剂，有利于哮喘；另一方面它又是引起气道慢性炎症的细胞毒性分子，可导致AHR。两者矛盾作用的结果如何呢？本组发现哮喘豚鼠肺组织cNOS活性水平变化不明显，说明哮喘时并不存在神经性NO的缺乏；而iNOS活性水平升高，导致BALF及肺组织NO水平随之升高，引起AHR而导致和(或)加重哮喘发病。吸入外源性NO虽然可轻度扩张支气管，但另一方面又可增加气道反应性，且目前认为哮喘的本质是呼吸道慢性炎症，而呼吸道平滑肌痉挛只是哮喘病理生理过程的一个组成部分，而非全部。所以我们认为哮喘时NO的主要作用系细胞毒性分子作用，吸入NO治疗哮喘需慎重。选择性抑制iNOS活性才是治疗哮喘的一个方向，也是糖皮质激素治疗哮喘的机理之一。当然这方面的研究尚需深入，很多问题有待进一步解决。

图1　豚鼠正常肺组织　NADPH阳性　×100　图2　豚鼠哮喘模型(哮喘组)肺组织　NADPH阳性　×100　图3　豚鼠哮喘模型激素治疗组肺组织　NADPH阳性　×100　图4　豚鼠哮喘模型LNNA治疗组肺组织　NADPH弱阳性　×100　图5　豚鼠正常支气管组织　NADPH阳性　×200　图6　豚鼠哮喘模型哮喘组支气管组织　NADPH阳性　×200　图7　豚鼠哮喘模型激素治疗组支气管组织　NADPH阳性×200　图8　豚鼠哮喘模型LNNA治疗组支气管组织　NADPH弱阳性　×200　图9　豚鼠正常气管组织　NADPH阳性　×200

　　参考文献

　　1　Lowenstein CJ, Synder SH. Nitric oxide, a novel biological messenger. Cell, 1992,70:705-709.

　　2　郭鹞.人类疾病的动物模型.北京：人民卫生出版社，1982.246-248.

　　3　Shi Y, Shen JG, Wang JH, et al. Plasma nitric oxide levels in newborn infants with sepsis. J Pediatr, 1993，123:435-438.

　　4　Bredt DS, Synder SH. Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci USA, 1990，87: 682-685.

　　5　Nichols K, Krautis A, Stain W. Histochemical localization of nitric oxide-synthesing neurous and vascular sites in the guinea-pig intestine. Neuroscience, 1992，51:791-799.

　　6　崔新乐，朱元珏.一氧化氮与哮喘.国外医学呼吸系统分册，1996，16:10-12.

　　7　Barnes PJ, Belvisi MG. Nitric oxide and lung disease. Thorax, 1993，48:1034-1043.

　　8　Dawson TM, Bredt DE, Fotuhi M, et al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH-diophorase are identical in brain and peripheral tissue. Proc Natl Acad Sci USA, 1991，88:7797-7801.

　　9　Furness JB, Pompolo S, Shuttleworth CWR, et al. Light and electron microscopic immunochemical analysis of nerve fiber types innervating the taenia of the guinea-pig caecum. Cell Tissue Res, 1992，270:125-137.

(收稿：1997-10-06　　修回：1998-01-13)