哮喘豚鼠内皮素、心钠素含量的变化及心钠素对内皮素含量的影响
中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 论 著
作者：戴山林 黄茂 王虹 殷凯生
单位：南京医科大学一附院呼吸科，江苏 南京 210029
关键词：哮喘；内皮缩血管肽类；心钠素；鸟苷环-磷酸
［摘 要］ 目的：探讨内皮素-1(ET-1)在哮喘发病中的可能作用及心钠素(ANF)对ET-1水平的影响。方法：采用放免法测定各组豚鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和血浆ET-1、ANF、cGMP含量。结果：哮喘组豚鼠血浆及BALF中ET-1、ANF、cGMP均显著高于对照组；哮喘组豚鼠血浆中ANF与ET-1含量呈显著负相关(r=-0.638，P＜0.05)；BALF中ET-1与ANF含量呈高度负相关(r=-0.921，P＜0.01)。哮喘组豚鼠血浆中ANF与cGMP含量呈显著正相关(r=0.848，P＜0.01)，BALF中ANF与cGMP含量呈显著正相关(r=0.831，P＜0.01)。哮喘+重组大鼠ANF(rANF)组豚鼠停止输注rANF后30 min，血浆及BALF中ET-1水平均明显低于哮喘组。cGMP水平显著高于哮喘组。结论：ET-1在哮喘的发病中可能有重要作用，ANF抑制ET-1合成及分泌。
［中图分类号］ R562.2+5 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)10-0906-03
Changes in endothelin-1 and atrial natriuretic
factor and the effect of atrial natriuretic factor on the change of
endothelin-1 in asthmatic guinea pigs
DAI Shan-lin HUANG Mao WANG Hong YING Kai-sheng
（Department of Pulmonary Diseases,the First Affiliated Hospital
of Nanjing Medical University,Nanjing 210029, China）
［Abstract］ AIM: To investigate the possible role of endothelin(ET-1) in asthma pathogenesis and the effect of atrial natriuretic factor (ANF) on changes of ET-1. METHODS: Measuring the contents of endothelin-1(ET-1),atrial natriuretic factor(ANF),cGMP in plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of guinea pigs. RESULTS: The contents of ET-1, ANF and cGMP in asthma group were higher than that of the control group; There was a significant negative correlation between ET-1 and ANF(r=-0.638,P＜0.05) in plasma of the asthma group, and a significantly negative correlation between ET-1 and ANF(r=-0.921,P＜0.01) in BALF of the asthma group. There was a significantly positive correlation between ANF and cGMP(r=0.848,P＜0 .01) in plasma of the asthma group,and a significantly positive correlation between ANF and cGMP (r=0.831,P＜0.01) in BALF of the asthma group. The levels ET-1 in the asthma+rat ANF(rANF) group were lower than those in the asthma group,and the levels of cGMP in the asthma+rat ANF(rANF) group were higher than those in the asthma group after ceasing to infuse rANF for guinea pigs for 30 minutes. CONCLUSION: ET-1 might play an important role in the pathogenesis of asthma.ANF might inhibit production of ET-1.
［MeSH］ Asthma; Endothelins; Atrial natriuretic factor; Guanosine cyclic monophosphate
内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是由内皮细胞合成和释放的一种活性多肽，除具有强烈的血管收缩作用外， 还可促进炎性细胞的激活，致支气管痉挛及气道炎症等，在哮喘的发病中起重要作用［1］ 。心钠素(atrial natriuretic factor, ANF)主要由心房肌细胞分泌，具有扩张血管、利钠、利尿等作用。近年研究发现，ANF还有舒张支气管平滑肌的作用［2］ 。本研究旨在观察哮喘豚鼠ET-1与ANF水平变化及有无相关性，以及外源性ANF在活体中对刺激性ET-1合成与分泌有无抑制作用，可望为支气管哮喘的治疗提出新思路。
材 料 和 方 法
一、材料
卵白蛋白(sigma公司)，大鼠28肽ANF(sigma公司)，ET-1放免测定盒(北京东亚免疫技术研究所)，ANF放免测定盒(北京北方免疫试剂研究所)，cGMP放免测定盒(上海中医药科大学同位素科)。
二、哮喘豚鼠模型的复制与动物分组
(一)哮喘豚鼠模型的复制参照刘朝晖等采用的方法［3］ 选择350-450 g成年雄性豚鼠，用10％卵白蛋白生理盐水1 mL腹腔内注射，2周后将致敏豚鼠放入半密闭的有机玻璃罩内，用超声雾化器喷入1％卵白蛋白生理盐水，在雾化室中放置1 min左右，以豚鼠腹肌明显收缩为阳性。隔日诱喘1次，共5次。
(二)350-450 g雄性豚鼠44只(江苏省实验动物中心提供)，随机分入以下各组：(1)对照组：豚鼠10只，用生理盐水1 mL腹腔内注射，2周后用前法雾化吸入生理盐水。(2)哮喘组：豚鼠10只，按上述方法复制哮喘豚鼠模型。(3)哮喘+rANF组：豚鼠24只，依剂量再分A、B、C组，每组8只， 按上法复制哮喘豚鼠模型后， 用电子微量泵分别以0.5,1.0, 2.0 μg*kg-1*min-1速度输注rANF 60 min。
三、实验方法
(一)将致敏豚鼠i.p.25％乌拉坦(1.2 g／kg)麻醉，分离一侧颈动脉并插管，置入雾化室中雾化吸入1％卵白蛋白生理盐水5 min左右，出现哮喘症状后5 min取颈动脉血经处理后待测ET-1、ANF和cGMP。在给气管插管后注入生理盐水10 mL， 反复抽吸3次，将抽取的支气管肺泡灌液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)低温离心(2 000 r/min，15 min)后取上清液待测上述指标。对照组也用上法采集标品待测。
(二)哮喘+rANF组豚鼠按上法诱发哮喘后，立即经大隐静脉建立输液通道。用电子微量泵分别以0.5, 1.0, 2.0 μg*kg-1*min-1速度输注rANF 60 min。rANF输注完毕30 min后采集样品的方法同上。
四、测定样品中ET-1、ANF、cGMP含量。
五、实验数据以
±s表示，采用t检验、方差分析及回归相关分析处理数据。
结 果
一、对照组和哮喘组豚鼠血浆及BALF中ET-1、ANF、cGMP含量(表1)
表1 对照组和哮喘组豚鼠血浆及
BALF中ET-1、ANF、cGMP含量
Tab 1 Levels of ET-1、ANF and cGMP in plasma and BALF
of the control group and the asthma group (±s. n=10)
| Group |
ET-1 (ng/L) |
ANF (ng/L) |
cGMP (nmol/L) |
| Control |
| Plasma |
200.0±47.0 |
89.0±17.7 |
2.1±0.6 |
| BALF |
18.5±3.8 |
49.5±11.2 |
0.7±0.2 |
| Asthma |
| Plasma |
427.0±67.0* |
418.0±90.0* |
3.9±1.1* |
| (times of elevation) |
(2.2±0.4) |
(4.8±1.0) |
| BALF |
84.7±8.9* |
239.0±63.5* |
1.9±0.2* |
| (times of elevation) |
(4.6±0.8)△ |
(4.9±1.3)▲ |
*P＜0.01 vs control;△P＜0.01 vs times of elevation in the plasma;▲P＞0.05 vs times of elevation in the plasma.
哮喘组BALF中ET-1水平升高倍数明显高于血浆中ET-1升高的倍数。哮喘组BALF中ANF水平升高倍数与血浆中ANF升高的倍数无明显差异。
二、ANF与ET-1、ANF与cGMP、cGMP与ET-1的相关性
哮喘组血浆中ANF含量与ET-1含量呈显著负相关(r=-0.638，P＜0.05)，BALF中ANF含量与ET-1含量呈高度负相关(r=-0.921，P＜0.01)。哮喘组血浆中ANF含量与cGMP含量呈显著正相关(r=0.848，P＜0.01)， BALF中ANF含量与cGMP含量呈高度正相关(r=0.831，P＜0.01)。哮喘组血浆中cGMP含量与ET-1含量呈显著负相关(r=-0.688，P＜0.05)，BALF中cGMP含量与ET-1含量呈高度负相关(r=-0.717，P＜0.05)。
三、哮喘豚鼠输注rANF前后血浆及BALF中ET-1及cGMP水平的变化(表2)
表2 哮喘豚鼠输注rANF后血浆及
BALF中ET-1及cGMP水平
Tab 2 Contents of ET-1 and cGMP in plasma
and BALF after guinea pigs infused rANF (x±s)Groupn Infuse rANF
(μg*kg-1*min-1)ET-1(ng/L) cGMP(nmol/L)
asthma 10
Plasma 427.0±67.8 3.9±1.1
bALF 84.7±8.9 1.9±0.2
Asthma+rANF
a group 8 0.5
Plasma 326.0±48.2* 10.2±2.4*
bALF 50.2±5.5* 3.1±0.8*
B group 8 1.0
plasma 280.0±32.9* 14.2±3.4*
BALF 42.4±4.8* 5.6±0.7*
c group 8 2.0
Plasma 246.0±34.3* 25.3±6.7*
bALF 31.6±3.8* 8.0±1.4* *P＜0.01 vs asthma.
结果提示哮喘+rANF各组ET-1水平均明显低于哮喘组(P值均＜0.01)，cGMP水平则明显高于哮喘组(P值均＜0.01)。
讨 论
本实验结果表明哮喘发作时血浆及BALF中ET-1的水平明显高于对照组，提示ET-1在哮喘的发病中可能起着重要作用。大量的实验证明ET-1能刺激培养的动物气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞合成花生四烯酸及其代谢产物，促进血小板活化因子(PAF)、白三烯、组胺及氧自由基的产生和释放，损伤气道上皮细胞，促进炎症细胞聚集及分泌多种炎症介质，诱发和加重哮喘的慢性气道炎症［1,4］ 。通过本研究结果可以推论到哮喘组豚鼠ET-1增加主要源于局部的合成及释放的增加并主要在局部发挥作用。
本研究结果显示哮喘组豚鼠血浆及BALF中ANF含量均显著高于对照组，且增加幅度相当。 故推论局部ANF的增加部分可能主要源于微血管渗漏。ANF增加与心房扩张、缺氧及ET-1升高有关［2,5］ 。ANF舒张支气管平滑肌的作用是通过激活细胞膜上ANF受体，继而激活颗粒鸟苷酸环化酶，使cGMP增加，细胞内游离Ca降低所致。本实验结果表明ANF与cGMP浓度呈显著正相关亦支持这种解释。
ET-1促进ANF的合成与分泌，ANF则抑制ET-1的合成与释放(包括基础合成与释放和刺激性合成与释放)并拮抗其作用［6,7］ 。本研究显示哮喘组豚鼠血浆及BALF中ET-1、ANF含量均显著高于对照组，推测ANF的增加可能与ET-1的作用有关。相关分析表明哮喘组豚鼠血浆及BALF中ET-1与ANF含量的变化呈显著负相关，cGMP与ET-1含量变化呈显著负相关，提示ANF对ET-1的合成及分泌可能有明显的抑制作用，且这种抑制作用可能是通过cGMP实现的。给哮喘豚鼠输注不同剂量的rANF 60 min对刺激性ET-1分泌影响的结果表明，停止rANF输注后30 min时，哮喘豚鼠BALF及血浆中ET-1水平明显低于哮喘组(P＜0.01)，且随着剂量的增大，对ET-1分泌的抑制作用越强，呈剂量依赖关系。同样地，停止rANF输注后30 min时，BALF及血浆中cGMP浓度明显升高，且随着剂量的增大，cGMP浓度相应升高，也呈剂量依赖关系。
ANF不仅能缓解支气管痉挛，而且能抑制ET-1的合成及释放，这对支气管哮喘的转归可能具有重要意义。但由于内源性ANF浓度较低，其舒张气道平滑肌及抑制ET-1合成及分泌的作用较弱。因此外源性ANF的使用可望成为哮喘病治疗的一种新方法。
［参 考 文 献］
［1］ Filep JG. Endothelin peptides:Biological action and pathophysio- logical significance in the lung［J］. Life Science,1993,52(27):119-133.
［2］ Perreault T,Gutkowska J. Role of atrial natiuretic factor in lung physiology and pathyology［J］. Am J Respir Crit Care Med,1995,151(1):226-242.
［3］ 刘朝晖,徐 军, 钟南山. 内皮素肿瘤坏死因子在哮喘发病中的作用［J］. 中华结核和呼吸病杂志,1995,18(6):366-368.
［4］ Rubanyi GM,Polokoff MA.Endothelins:Molecular biology,biochemistry, pharmacology, physiology, and pathophysiology［J］. Pharmacological Reviews,1994,46(3):325-415.
［5］ Suzuki E,Hirata Y,Kohmoto O,et al.Cellular mechanisms for synthesis and secretion of atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide in cultured rat atrial cells［J］. Cir Res, 1992, 71(5):1039-1048.
［6］ Vesely DL,Chiou S,Douglass MA,et al.Atrial natriuretic peptide negatively and positively modulate circulating endothelin in human［J］. Metabolism,1996,45:315.
［7］ Hu RM,Levin ER,Pedram A,et al.Atrial natriuretic peptide inhibits the production and secretion of endothelin from cultured endothelial cells. Mediaton through the C receptor［J］.J Boil Chem,1992, 267:17384-17389.
［收稿日期］ 1999-06-18
［修回日期］ 1999-12-17
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