哮喘患者不同期外周淋巴细胞β肾上腺素能受体的变化
中国病理生理杂志 2000年第3期第16卷 论著
作者：高海鹏 林友华 薛全福 朱广瑾
单位：高海鹏 林友华（中日友好医院呼吸科，北京 100029）；薛全福 朱广瑾（中国协和医科大学基础医学院，北京 100005）
关键词：哮喘；缓解，自行；发作；受体，肾上腺素能，β
［摘 要］ 目的：研究不同期哮喘患者外周淋巴细胞β肾上腺素能受体数量及功能的变化。方法：用放射配基结合分析及放射免疫分析法测定外周淋巴细胞β肾上腺素能受体和血浆cAMP、cGMP水平，同时测定通气功能。结果：缓解期哮喘患者外周淋巴细胞β肾上腺素能受体最大结合量(Bmax)较正常人明显增高，平衡解离常数(Kd)亦增高，血浆cAMP水平无显著差异；发作期哮喘患者β肾上腺素能受体Bmax较正常人显著降低，Kd值无明显差异，而血浆cAMP水平则显著降低。结论：哮喘时β肾上腺素能受体的改变与哮喘患者所处状态有关，是其发病过程中伴随出现的病理变化。
［中图分类号］ R 562.2＋5 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)03-0193-03
Changes of β-adrenoceptors in peripheral lymphocytes at different stages of asthma
GAO Hai-peng, LIN You-hua,
(China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China)XUE Quan-fu, ZHU Guang-jin
(Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
［Abstract］ AIM:To study the changes of β-adrenoceptors in peripheral lymphocytes at different stages of asthma.METHODS:β-adrenoceptors in peripheral lymphocytes, cAMP and cGMP levels in blood plasma were measured by radioligand binding assay and radioimmunoassay.RESULTS:Bmax and Kd of β-adrenoceptors in asthma at remission stage were markedly higher than that in normal subjects, while cAMP levels in blood plasma were not different between them. Bmax of β-adrenoceptors and cAMP levels in blood plasma in asthma at acute exacerbation stage were significantly lower than that in normal subjects, Kds between these two groups were not much different. There was no correlation between β-adrenoceptors, cAMP and cGMP levels in blood plasma and ventilatory functions.CONCLUSIONS:Changes of β-adrenoceptors in asthma rather be a pathological change accompanied by the course of the disease than a primary defect.
［MeSH］ Asthma; Remission, spontaneous; Seizures; Receptors, adrenergic, beta
自从1968年Szentivanyi［1］提出支气管哮喘(简称哮喘)发病的β肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor, βAR)阻滞学说以来，人们对哮喘时βAR的变化进行了大量临床和实验研究，但结果常常是相互矛盾的。由于在人体取材困难，常通过测定外周淋巴细胞βAR来反映气道βAR的变化［2］。我们曾报道缓解期哮喘患者外周淋巴细胞βAR密度较正常人明显增高，并推测βAR的这种变化可能与哮喘患者所处状态有关，只是哮喘病程中伴随出现的一种病理变化［3］。本研究拟进一步对不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR及血浆cAMP、cGMP水平变化进行比较，以期探讨不同状态哮喘患者βAR数量及功能变化规律，同时测定通气功能，并分析βAR与cAMP、cGMP及通气功能之间的相关。
材 料 和 方 法
一、对象
缓解期哮喘患者19例，男10例，女9例，年龄22～63岁。发作期哮喘患者11例，男10例，女1例，年龄33～65岁。受试者检测前24 h停用支气管扩张剂，采血前48 h停用βAR激动剂，6个月未用任何糖皮质激素［4］。正常人12例，男6例，女6例，年龄18～56岁。无心肺及其他器官器质性疾病，无过敏性疾病史。1月内无上呼吸道感染。
二、主要仪器与试剂
Beckman Gamma 5500同位素仪(USA)；Beckman LS-9800液闪计数仪(USA)；Chest HI-498肺功能仪(Japan)；醋酸纤维滤膜49＃(上海虹光造纸厂)；125ICYP(Amer sham);cAMP、cGMP测定试剂盒(均为中国原子能科学研究院)。
三、方法
(一)外周淋巴细胞βAR测定 取4～5 mL抗凝外周静脉血，常规分离外周淋巴细胞，PBS液配成4×106～8×10６个单核细胞/mL的均匀悬液。台盼蓝排除试验显示淋巴细胞存活率＞95%。取总结合与非特异结合管各6管，并各设平行管。每管内加淋巴细胞悬液50 μL，放射活性配基氰心得静(125iodocyanopindolol,［125I］CYP) 20 μL，(终末浓度25～200 pmol/L，共设6个不同浓度梯度)。总结合管内加Tris-HCL缓冲液5 μL，非特异结合管内加心得舒液5 μL(终末浓度为10 μmol/L)。总反应体积均达到75 μL。37℃水浴1 h。加5 mL预冷的Tris-HCL缓冲液终止反应，立即倾倒在双层醋酸纤维滤膜上减压抽滤，以5 mL同样液体洗涤试管2次，抽滤。将膜片置于Beckman Gamma 5500同位素计数仪内计数。不同放射配基浓度非特异结合占总结合的20%～40%。所得数据经Scatchard公式转换求得受体最大结合容量Bmax和平衡解离常数Kd(Scatchard作图均为直线，且直线方程的回归系数在统计学上有显著意义)。(二)血浆cAMP、cGMP水平测定 取2.5 ml抗凝外周静脉血，4℃分离出血浆，无水乙醇凝结蛋白，沉淀并以75%乙醇洗涤，取上清置60℃水浴吹干，-20℃存放。分别采用［3H］标记的cAMP、cGMP试剂盒进行测定。加入50 mmol/L醋酸缓冲液(1/2血浆体积)溶解样品干渣，加样50 μL，同时制备标准曲线。每次测定均取双管，经过加样，保温，微孔滤膜抽滤，膜片烤干等过程，Beckman LS-9800液闪计数仪计数，从标准曲线计算血浆cAMP、cGMP含量。(三)肺通气功能测定 Chest HI-498肺功能仪测定通气功能FEV1，FEV1/FVC，PEFR。
结 果
一、不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR的Bmax、Kd及血浆cAMP、cGMP水平、通气功能与正常人的比较见表1。
表1 不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR的Bmax, Kd,血浆cAMP,cGMP水平及通气功能
Tab 1 βAR in peripheral lymphocytes, cAMP, cGMP levels in blood plasma and ventilatory function
of normal subjects and asthmatics in different stages(
±s)
| Group |
Bmax
(receptors/per cell) |
Kd
(pmol/L) |
cAMP
(pmol/mL) |
cGMP
(pmol/mL) |
FEV１
(mean/pred%) |
FEV１/FVC
(mean/pred%) |
PEFR
(mean/pred%) |
| NS |
1496±405
(n=12) |
15.84±9.60
(n=12) |
19.1±8.8
(n=12) |
2.4±1.3
(n=12) |
98.81±13.22
(n=10) |
87.51±13.60
(n=11) |
90.16±15.62
(n=10) |
| AR |
2593±1608**
(n=19) |
32.39±22.62
(n=19) |
16.3±7.5
(n=18) |
4.7±3.7
(n=13) |
87.51±17.94
(n=12) |
86.39±20.64
(n=16) |
80.28±20.54
(n=12) |
| AW |
1072±550*
(n=11) |
15.06±9.02
(n=11) |
12.7±4.5*
(n=9) |
4.2±3.5
(n=5) |
36.43±12.54*
(n=7) |
56.41±23.81*
(n=11) |
43.77±30.56*
(n=7) |
*P＜0.05，**P＜0.01，vs NS； NS：normal subjects; AR:asthmatics in remission stage; AW:asthmatics in worsening stage 二、不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR的Bmax、Kd与血浆cAMP、cGMP之间未见相关。
三、不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR的Bmax、Kd与通气功能之间未见相关。
讨 论
自从1976年Williams［5］用［３H］-DHA首次成功地测定了人外周淋巴细胞βAR后，人们对哮喘患者外周淋巴细胞βAR进地了定量测定，然而结果常常是互相矛盾的。早期的一些研究结果显示哮喘患者外周淋巴细胞βAR数量及功能均降低，似乎与Szentivanyi［1］假说相吻合，但其后的一些实验则认为哮喘患者外周淋巴细胞βAR的数量和功能与正常人比较均无显著差异。Spina等［6］用一种高比放射性配基［125I］CYP通过放射自显影技术在1例哮喘患者尸检中首次发现其肺内βAR密度较正常人明显增高。Bai等［7］用放射配基结合分析法进行的实验得到了相似的结果。吕宝璋等［8］在对哮喘豚鼠外周淋巴细胞βAR进行49 d的动态观察后认为，βAR的变化与哮喘病程有关，17 d以前βAR密度增高，随后逐渐降低，21 d后显著下降。我们曾测定缓解期哮喘患者外周淋巴细胞βAR，发现其密度较正常人明显增高［3］，因而推测哮喘时βAR变化在人可能与哮喘不同状态有关。然而，迄今为止，尚未见不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR数量及功能变化的报道。
19例临床缓解期哮喘患者外周淋巴细胞βAR测定结果显示，其密度较正常人明显增高，这与我们以前的观察结果一致［3］，也与Spina等［6］及Bai等［7］在哮喘患者肺内的测定结果相印证。与此同时，11例发作期哮喘患者外周淋巴细胞βAR密度较正常人明显降低。Brooks等［4］认为，外周淋巴细胞βAR密度与哮喘严重程度呈负相关。Meurs等［9］的实验也表明，哮喘患者外周淋巴细胞βAR数量仅仅在受到抗原刺激，即哮喘呈“急性发作状态”时才出现明显下降。这可能由于在哮喘发作期，应激反应和缺氧使血中儿茶酚胺水平升高，而持续时间较长的儿茶酚胺增高可使外周血细胞βAR数量下调。因此，这些结果提示哮喘时βAR的改变不是哮喘发病的原发因素，而是其发病过程中伴随出现的一种调节性变化。βAR的Kd值测定显示，缓解期哮喘患者较正常人有意义地增高，其临床意义尚不清楚。发作期哮喘患者βAR的Kd值与正常人相比无显著差异。
作为一个整体，我们除了测定外周淋巴细胞βAR数量外，还进一步测定了不同期哮喘患者血浆cAMP、cGMP水平，并以此更准确地反映βAR所处的功能状态。既往实验表明，βAR激动剂可引起效应细胞内cAMP含量增高，这些cAMP会通过细胞外间隙而进入血液。这样，组织细胞内cAMP增加就伴有血浆cAMP增加。我们的研究结果表明，缓解期哮喘患者血浆cAMP、cGMP水平与正常人无明显差异。结合缓解期哮喘患者βAR密度增高而结合亲和力降低，我们认为，增加的βAR并未出现功能亢进。发作期哮喘患者cAMP水平显著降低，表明哮喘急性发作时，βAR不仅在数量上明显减少，其功能亦受到明显损害。这与多数作者的结果一致。血浆cGMP水平在缓解期哮喘患者较正常人有意义地增高，而哮喘发作期虽有增高趋势，但无统计学差别，是否与测定例数较少有关，尚待进一步证实。
实验还显示，不同期哮喘患者外周淋巴细胞βAR的Bmax、Kd与血浆cAMP、cGMP水平未显示明显相关，表明哮喘时βAR及血浆cAMP、cGMP水平变化是由各自独立的因素，或由多种不同的复杂因素决定的。此外，我们的结果也未能显示哮喘患者外周淋巴细胞βAR与通气功能之间有任何相关。这与Meurs等［10］的结果一致。提示影响气道阻塞的因素不是单一的，而可能是多种因素相互作用的结果。
［基金项目］ 国家自然科学基金；卫生部科学研究基金资助。本文获中国病理生理学会缺氧和呼吸分会青年优秀论文一等奖 国家自然科学基金；卫生部科学研究基金资助。本文获中国病理生理学会缺氧和呼吸分会青年优秀论文一等奖
［参 考 文 献］
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［3］ 高海鹏，林友华，薛全福，等. 支气管哮喘患者外周淋巴细胞β肾上腺素能受体，通气功能及气道反应性之间的相关［J］. 中日友好医院学报，1993，7：100～103.
［4］ Brooks SM, McGowan K, Bernstein IL, et al. Relationship between numbers of beta adrenergic receptors in lymphocytes and disease severity in asthma ［J］. J Allergy Clin Immunol, 1979,63:401～406.
［5］ William L T, Snyderman R, Lefkowitz RJ. Identification of beta-adrenergic receports in human lymphocytes by (-) ［3H］-alprenolol binding［J］. J Clin Invest, 1976, 57:149～155.
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［7］ Bai TR, Mak JCW, Barnes PJ. A comparison of beta-adrenergic receptors and in vitro relaxant responses to isoproterenol in asthmatic airway smooth muscle［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 1992, 6:647～651.
［8］ 吕宝璋，付国辉，单京瑞，等. 实验性过敏性哮喘豚鼠外周淋巴细胞β肾上腺素能受体系统的变化［J］. 中国病理生理杂志，1987，3：201～205.
［9］ Meurs H, Van den Bogaard W, Kauffman HF, et al. Characterization of (-) ［3H］-dihydroalprenolol binding to intact and broken cell preparations of human peripheral blood lymphocytes［J］. Eur J Pharmacol, 1982, 85:185～194.
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［收稿日期］1999-02-04 ［修回日期］1999-09-03
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