VEGF与缺血性心脏病及其在法医学的应用
法律与医学杂志 1999年第1期第0卷 综述
作者：陈建国 徐小虎
单位：陈建国（中山医科大学法医病理学教研室，广州，510089）；徐小虎（汕头大学医学院法医研究所，广东汕头，515031）
徐小虎(审校)
Study advance of VEGF in ischemic heart disease and prospect in the field of forensic medicine Chen Jianguo, Xu Xiaohu. Department of Forensic Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089
【Abstract】Vascular endothelial growth factor (VEGF or Vascular permeability factor) is a 46-kD, dimeric heparin-binding glycoprotein which was identified as a highly specific growth factor for vascular endothelial cells in vitro. Recent studies indicated that VEGF receptors (flk1/KDR and flt-1) are up-regulated under some pathological conditions such as hypoxia, cardiac ischemia, wound healing. These observation results consisted with the concept that VEGF is an endogenous mediator of angiogenesis. The main research progress of VEGF and its expression in inchemic heart disease as well as practical value in forensic medicine were reviewed in this article.
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF)早先被称作血管渗透因子(Vascular Permeability Factor VPF)和血管调理素(Vasculotropin),是一种特异作用于血管内皮细胞的强有力的多功能细胞因子［1］。它强烈而特异地促使内皮细胞分裂增殖、增生、转移，增加血管通透性并促进新血管生成。它促进血管内皮细胞的有丝分裂作用是通过存在于内皮细胞表面VEGF的特异性受体所介导的［2～4］。在正常情况下，VEGF参与周期性黄体形成，组织器官修复和胚胎发育等［5］。在病理情况下，如肿瘤的发生发展，类风湿性关节炎，以及一些缺血缺氧性疾病等，VEGF的表达都会增加并参入到促进新血管的生成过程中。有研究证实心肌缺血缺氧可促使心脏局部受损心肌细胞的VEGF及其血管内皮细胞上的VEGF受体表达增高［6］，因此，本综述将对VEGF的研究概况及其与缺血性心脏病的关系以及在法医学中的应用前景进行讨论。
一、VEGF概述
VEGF是一种分子量为46kDa的二聚体糖蛋白［7～8］，由两个分子量相同(23kDa)的亚基经二硫键结合而成。通过测定VEGF分子量的大小，以及RNA印迹杂交条带的不均一性和cDNA PCR扩增显示的多片段，表明VEGF是由多个成员组成的家族［8～10］。不同形式的VEGF是同一基因不同方式的mRNA水平剪接而形成的。根据VEGF含有的氨基酸数量的不同，一共有4种不同的VEGFs形式，它们分别是VEGF121，VEGF165，VEGF189和VEGF206［2，11，12］。其中，VEGF121和VEGF165是分泌型的蛋白质。VEGF121不能与肝素结合，VEGF165则有50%以上与细胞膜或基底膜上含有肝素的蛋白聚糖类物质结合。VEGF189和VEGF206的性质相同，对肝素亲合力更强，这可能与它们对细胞表面蛋白多糖有更大亲合力有关［12］。虽然VEGFs的4种不同形式在生物性质上有所不同，但其生物学活性是一样的。
人VEGF基因位于染色体6P21.3［9］，全长14kb，由8个外显子和7个内含子构成，外显子与内含子相间排列。通过Northern印迹分析法发现它包括3个VEGF的转录单位，分别为5.5，4.4和3.7kb。运用PCR和cDNA克隆技术分析VEGF在这些平滑肌细胞中的转录得知有3种不同形式的VEGF编码区，3种不同形式的VEGF编码区主要通过外显子不同剪接方式得到，其中涉及到不同剪接方式的外显子主要是6和7。从这3个编码区得到的3种人VEGF蛋白链的氨基酸长度分别是121，165和189。VEGF165是因为失去了外显子6所编码的氨基酸残基，而VEGF121是因为失去了外显子6和7所编码的氨基酸残基。如果两个外显子均参与编码氨基酸则可产生出VEGF189。
二、VEGF表达调控及其生物学活性
VEGF可在很多正常成人和动物组织中表达，但一般水平较低。胚胎组织、胎盘、增殖期的子宫内膜、黄体等，由于生长发育和血管生成的需要，VEGF的表达往往呈较高水平。在病理情况下，特别是在肿瘤细胞中，VEGF无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均有过量表达。另外，在缺血缺氧的心肌细胞中也可观察到VEGF的过量表达，缺氧是诱导心肌细胞表达VEGF最强烈的因素之一［13］。
VEGF表达的调节机制迄今还不是十分清楚，一些血清来源和旁分泌产生的生长因子与细胞因子包括血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转移生长因子(TGF)和白细胞介素(IL-s)等都能使许多培养细胞VEGF表达3～20倍。不过除了PDGF外，其它因子都不能直接促使培养的微细血管内皮细胞进行有丝分裂，因此，观察到它们促使内皮细胞的有丝分裂活动均是通过诱导VEGF表达来实现的［14～16］。
众所周知，缺氧能诱导新血管生成，因此提供一种补偿机制以使缺氧组织增加供氧。故此，低氧是正常和异常组织VEGF及其受体表达的主要诱导因素之一［17］。实验证明将许多不同来源的细胞在氧分压从21%降到0%～3%的范围培养时，则可增加VEGFmRNA水平10～50倍。体内肿瘤缺氧区同样可以诱导VEGF表达［17］。另外结扎豚鼠冠状动脉造成心肌缺氧也可在心脏导致VEGF过度表达［18］。
关于缺氧能增加VEGF表达的机制目前还不甚清楚，Coldberg等［19］发现CoCL可以促进VEGF表达，而CO则抑制它的表达。此种情况类似CoCL刺激因缺氧诱导的红细胞生成素的表达，此表达被认为是由于钴替代了卟啉环中的铁(一种假想的血红蛋白中的氧探测器)的结果，钴替代铁后致使血红蛋白对氧的亲合力下降而促使脱氧变构。相反，CO却与氧紧密结合从而失去了感受有氧构型的功能，因此抑制了缺氧的反应。同样或是相似的调节蛋白可以调控VEGF和促红细胞生成素的转录。得以使人们多年来观察到的缺氧对VEGF表达的调节作用在基因水平上找到了依据。
最先发现的VEGF的生物学活性是它能够增加微小血管，主要是后毛细血管和小静脉对大分子的通透性，它是目前所知的最有效的血管通透因子，其浓度在lnmol/L以下即可发挥比同浓度组胺大50 000倍的效果［1，20］。注射VEGF几分钟之内即可发生血管渗透效应，但单次注射作用持续时间短暂(仅为30min左右)且可逆。血管渗透性的增加并不是损伤内皮细胞或血管其它因素的结果。VEGF增加血管渗透性的作用不能被抗组胺或其它一些炎症抑制因子所阻断［20］。
VEGF除了能增加血管通透性作用外，还对整个血管系统的内皮细胞有促有丝分裂作用，它是目前所知最有选择性的血管内皮细胞有丝分裂剂。另外，VEGF还通过血管内皮细胞引起一些非有丝分裂反应，包括趋化性，纤维蛋白溶酶原和胶原酶的表达，以促进生长的毛细血管穿透侵入组织［21～23］。
三、VEGF与心肌缺血的关系
心肌缺血是由于冠状动脉硬化或栓塞等情况引起的心肌血供减少，此时必然会导致氧供降低并伴随代谢废物的潴留。心肌缺血缺氧之后必然会刺激侧枝循环的形成以代偿组织的需要，许多学者开始对此过程的分子学基础进行研究［17，18］，他们发现缺血缺氧能够引起一些血管生成的因子如VEGF的上调［13，18］。在某些病理情况下，VEGF可以迅速增加。Hashimoto等［24］在体内试验时观察到，当心肌缺血5～10min时，心肌细胞内可出现VEGFmRNA表达，直至30min时达到高峰，并且至少可以维持3h。Banai等［18］在进行心肌细胞体外培养试验中也观察到了类似的结果，他们发现，在体外当心肌细胞缺氧2～4h，细胞内VEGFmRNA的水平增高了6～10倍，而在体内，当心肌缺血时，心肌细胞中的VEGFmRNA水平可以增高3～5倍。一般认为，血管内皮细胞只是VEGF特异性作用的靶细胞，其本身并不表达VEGF，不过，在缺血缺氧情况下，血管内皮细胞膜上VEGF受体可以出现高度表达。Li等［25］对大鼠心肌梗塞模型血管生长因子VEGF及其受体在心肌细胞和血管内皮细胞上的表达进行了研究。他们观察到VEGF表达在心肌梗塞后lh就显著上升，达到基础值的2.5倍，以后7d继续显著上升一直到6周左右降到基础水平。两种VEGF受体的mRNA表达也显著增加并持续一段时间，活动趋向与VEGF的表达一致。Flk-l受体表达在心肌梗塞一小时后增加3.7倍，持续增加72h一直到7d左右开始下降，到6周降至正常水平，但flt-l受体表达的时间却与flk-l不一样，直到心肌梗塞6h后才达到高峰，同时他们还观察了VEGF及其受体在梗塞心脏不同部位的表达，左冠状动脉结扎后，梗塞与非梗塞区均有VEGFmRNA表达，不过非梗塞区只持续3d到7d时则下降至正常，而梗塞区及其周边部位的高水平表达可持续7d以上。但是，一旦缺血缺氧局部血氧供应恢复正常时，局部过度表达的VEGF则迅速下降，一般来说，在24h以内就会降至正常水平［26］。
四、VEGF在法医学的应用前景
综上所述，VEGF在心肌缺血性损伤时的表达具有以下特点：1.很快出现表达上调，心肌缺血5～10min时，VEGF基因在心肌细胞内明显表达，30min时达到高峰。2.一旦出现表达可以至少维持3h。3.缺血缺氧诱导VEGF表达时还需要一个前提条件，就是要在缺血缺氧组织局部形成氧梯度，一旦这种氧梯度不存在或是消失，那么VEGF就不会表达或是表达上调的VEGF开始下降。4.局部缺血缺氧组织在血氧供应恢复正常后，表达上调的VEGF一般在24h内降至正常［26，27］。
由于缺血性心脏病时心肌缺血的一个重要特点是缺血一般不是全心性的，而是某支(或几支)冠脉支配的局部心肌的缺血，具有不均一性。另外心肌缺血缺氧之后会刺激侧枝循环的形成以代偿组织的需要。许多学者开始对此过程的分子学基础进行研究。他们发现缺血缺氧能够引起一些促血管生成的因子如VEGF的上调。目前还未见有VEGF在法医学检案实践工作中的应用报道。不过正是由于VEGF以及心肌缺血具有以上特点，可以想象法医工作者在法医检案实践中利用特异性和敏感性较高的免疫组化技术，再结合图像分析系统，研究心肌缺血早期局部心肌细胞内VEGF的表达，可望作为因心肌缺血导致心脏性猝死案例死后诊断灵敏而又具有较高特异性的病理形态学指标之一。笔者曾对实验大鼠急性心肌缺血早期VEGF的表达应用免疫组化技术进行了研究(资料另文发表)，发现心肌缺血30min即可在缺血心肌局部检测到VEGF的表达，3h达到高峰。同时也对冠心病猝死案例的心脏标本心肌VEGF的表达应用免疫组化进行了研究，发现均出现阳性结果，而对照组均为阴性。图像定量分析处理结果表明两组有极显著性的差异，说明VEGF免疫组化染色结合图像定量分析处理对于冠心病猝死的死后诊断具有很高特异性和灵敏性，在法医检案实践中对于心脏性猝死的诊断具有重要的实际意义。可以预见检测VEGF的表达在因急性心肌缺血导致的心脏性猝死死后诊断中的应用具有广阔的前景。
徐小虎（汕头大学医学院法医研究所，广东汕头，515031）
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(收稿：1998-10-09，修回：1998-12-14)
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