凝血因子Ⅴ多态性、活性与冠心病关系的研究
中华心血管病杂志 2000年第1期第28卷 冠心病研究
作者：乐玮 于金德 陆林 陶蓉 尤蓓 龚兰生
单位：乐玮（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）；于金德（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）；陆林（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）；陶蓉（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）；尤蓓（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）
关键词： 凝血因子Ⅴ；冠心病；多聚酶链反应-变性梯度凝胶电泳；APC抵抗
摘 要：目的 探讨凝血因子Ⅴ（FV）与冠心病(CHD)发病的关系。方法 在141例CHD和145例健康人作对照组，运用多聚酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）筛查FV基因全部外显子，随机对其中55例CHD和55例健康人对照进行FV活性和APC抵抗(APCR)的测定，并统计分析。结果 发现5个多态性：10号外显子1628G→A(Arg→Lys)、2号外显子327A→G(Gln51)、4号外显子642G→T(Ser156)、16号外显子5380G→A(Val→Met)和13号外显子4070A→G(His→Arg)。其中2号外显子327A→G(Gln51)是首次报道，在CHD组和对照组中均未检测到Leiden突变。在CHD组和正常对照组之间1628G→A(Arg→Lys)多态性等位基因频率差异有极显著性(P＜0.01)，CHD组APCR发生率高于正常对照组(P＜0.05)，且1628G→A(Arg→Lys)多态性等位基因频率与APCR存在相关性。结论 FV基因1628G→A(Arg→Lys)多态性与APCR，CHD发病相关，可能是冠心病发病的危险因素之一。
Investigation on the relationship between polymorphism of coagulation factor V gene and coronary heart disease
LE Wei YU Jinde LU Lin, et al.
（Department of Cardiology, Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China）
Abstract：Objective To ascertain the relationship between coagulation factor V (FV) and coronary heart disease (CHD).Methods FV gene was screened by PCR-DGGE in 141 cases with CHD and 145 controls, activated protein C resistance (APCR) ratio of FV was measured in 55 cases with CHD and 55 healthy controls by APTT and the number of APCR involvement in each group was documented.Results Eight cases with APCR was detected in CHD group and 4 cases in controls with statistical difference in distribution (P＜0.05). Genetically, five types of polymorphism were found and the allele frequency of 1628G→A (Arg→Lys) polymorphism differed significantly between the two groups. Allele A1628 was related with lower APCR ratio and more APCR cases (P＜0.05).Conclusion Arg→Lys polymorphism of FV is associated with APCR and CHD morbidity and it might be a risk factor for CHD in the Chinese population.
Key words：Cagulation factor V; Coronary heart disease; PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis; Activated protein C resistance
凝血活性增高和(或)抗凝纤溶能力降低与冠心病发病密切关联［1］。凝血因子Ⅴ(FV)是凝血过程中的重要辅助因子，参与形成激活凝血酶原的转化复合物。生理状况下，活性蛋白C(APC)通过水解FV的Arg306、Arg506和Arg679三个位点将其灭活，以维持凝血-纤溶系统的动态平衡［2］。目前已发现FV基因存在诸多突变和多态性，如：10号外显子1691G→A(Arg506Gln)，即Leiden突变；13号外显子4070A→G(His1299Arg)、3894T→C(Ser1240)、3943C→A(Leu1257Ile)，4号外显子642G→T(Ser156)，16号外显子5380G→A(Val1736Met)和10号外显子1628G→A(Arg485Lys)。其中Leiden突变恰巧位于APC降解FV的特殊位点Arg506，导致FV灭活障碍，形成APC抵抗，造成高凝遗传基础［3］，Leiden突变是APC抵抗的主要原因。临床研究发现家族性高凝患者中50%以上有Leiden突变［4］，另有报道白种女性(n=10 540)心肌梗塞发病与Leiden突变相关［5］。本研究在141例冠心病和145例健康人对照中，运用多聚酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）筛查FV基因全部外显子，对其中55例冠心病和55例健康人对照还进行FV活性和APC抵抗(APCR)的测定，以期明确FV基因的多态情况，并探讨这些多态性与冠心病发病的关系。
对象与方法
1.研究对象：CHD组141例，男性107例，女性34例，年龄(64.8±7.73)岁，来自本院心血管病房，经冠状动脉造影证实。对照组145例，男性105例，女性40例，年龄(56.5±6.2)岁，来自门诊常规体检者，经病史、体检和实验室检查确认健康者。
2.资料收集：检查CHD组和对照组成员的血压、心率、血脂、血糖，了解病史、吸烟情况等。
3.模板DNA置备：采CHD组和健康对照组成员的外周血5 ml，用3.8%柠檬酸钠抗凝，室温下分离乏血小板血浆，并抽提白细胞DNA，溶于TE中。
4.筛查片段的PCR扩增：应用Bio-Rad公司MacMelt软件对待查DNA序列进行分析，设计35对引物(见表1和表2)，扩增全部外显子及其两翼部分内含子序列。根据PCR扩增片段的模拟电泳解离行为，决定在一侧引物的5′端加由39G/C碱基组成的“GC-夹”，使PCR产物一端形成Tm较高不易解链的“夹子”，DNA扩增在Pelkin-Elma 9600 PCR仪上进行，50 μl体系中含0.5-1 μg基因组DNA、5 μl 10×PCR反应缓冲液、3 μl 25 mmol/L MgCl2、1 μl 10 mmol/L dNTP、0.5 μl 50 mmol/L的一对引物、1.2 μ Taq DNA聚合酶。反应条件：94℃变性5 min，然后94℃45 s；46-53℃1 min；72℃1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。
表1 PCR引物序列及DGGE条件
| 外显子 |
引物序列
（5′→3′） |
扩增片段
(bp) |
PCR退火
温度(℃) |
DGGE温度
(℃) |
变性梯度
范围(%) |
电压
(V) |
电泳
时间 |
| 1 |
TAGCAGCTCGGCAAGCG
 TCCACACCTGAGTTACCTT |
280 |
50 |
60 |
40-70 |
70 |
15 |
| 2 |
TTAGTTTTTGTATTTTATTTCCAG
ATTACCCATAGAAATTTATCTTTA |
208 |
53 |
50 |
30-70 |
80 |
15 |
| 3 |
ACCCTGAATACAGACATAGTT TTAGACATTTTCCCTTTTCAGA |
246 |
50 |
50 |
30-70 |
80 |
16 |
| 4 |
CTGCCCACATGTCTTGAT
AACATTTAGTTGTTGAATCTTT |
328 |
48 |
55 |
40-70 |
70 |
15.5 |
| 5 |
TGCAGTGCTACTGAAAACAT
TTAATGGTACACAGCCCTC |
246 |
50 |
54 |
30-70 |
70 |
15 |
| 6 |
CCCTCTTTCTCAGATATAAC
AAGCAAGACTGTCAGGAGA |
303 |
49 |
54 |
30-70 |
70 |
15 |
| 7 |
TCATTGTCTTTCTGTCCTAAC
CCTTTGCCCAGTGGTATGA |
265 |
50 |
54 |
30-70 |
160 |
7 |
| 8 |
ATTTGAGAAAGTGGTTTAATTT
TCCCATGATTCTGTATTTGT |
288 |
46 |
56 |
30-70 |
180 |
6 |
| 9 |
GATTTAACTTTGTAGATCGTG TTACTAGTTGGATTCAGTAGA |
192 |
50 |
54 |
40-60 |
70 |
15 |
| 10 |
TCATGAAATAACTTTGCAAATG
CTGAAAGGTTACTTCAAGGA |
334 |
51 |
51 |
40-70 |
70 |
15 |
| 11 |
ATGCGTCTGTTCTTGTACC CAAAAATAGTACTCTGACTTAC |
257 |
53 |
54 |
40-70 |
70 |
15 |
| 12 |
CATAGACTTGGAATTTTAACAG
TCCTCTGTGAGTGTCCAGA |
320 |
53 |
54 |
30-70 |
70 |
15 |
| 14 |
ATAGTATTATTATTTCAGGGAA
GCTCAAAAGACTTACTTGG |
268 |
50 |
51 |
40-70 |
80 |
15 |
| 15 |
GATCATTCCTTTTCCTAGGT
CCTACTGGGTTCACAGCT |
300 |
50 |
51 |
40-70 |
80 |
15 |
| 16 |
TTTACTCTGTTTTTCCAGGA
ACTCATGGGATTTTTTCATTT |
263 |
50 |
52 |
40-70 |
70 |
15 |
| 17 |
TGATTTCAACTCTTGTCTTCA
AGATTGCCTTTTCCCTGTAT |
300 |
51 |
54 |
40-70 |
70 |
15 |
| 18 |
ATGTTGTTCTTTTTATTTTAGG
TTGTGATACCTCTGTCCAT |
188 |
49 |
54 |
40-60 |
80 |
15 |
| 19 |
ATAATCCCTAACCATGGAGT TGCTACAACTTACCCAGAA |
205 |
49 |
54 |
40-70 |
80 |
15 |
| 20 |
TTCCCTTGAGTTTAGGTTAC CACTTTCATTTTTATTATTACGA |
217 |
51 |
51 |
40-70 |
70 |
15 |
| 21 |
CAGTGTGTGACTTGTTGAC GAGATTCAGATAGAAATATGC |
281 |
51 |
54 |
40-70 |
80 |
15 |
| 22 |
ACTTTCCTCTTTTCTTCTAG
AATAATGCATCTTTGTACCTT |
228 |
49 |
50 |
30-70 |
70 |
15 |
| 23 |
AATCACGTTACTTTTCTTTTG
TATACTTGACCTTGGCTTG |
227 |
48 |
54 |
40-70 |
80 |
15 |
| 24 |
TTTTAACATCTTCCTTATCTAT
CACAGTCTTCAGATTGCTT |
311 |
48 |
50 |
40-70 |
70 |
15 |
| 25 |
TTTCTCTTATTTGGCTTTCAG
GTTAACATTTAACACAGCGT |
300 |
50 |
50 |
40-70 |
70 |
15 |
注：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCGC-3′，本表为所有外显子（除外13号外显子）的PCR引物序列及DGGE反应条件符号表示40-bp GC夹
表2 13号外显子引物序列及DGGE条件
| 外显子 |
引物序列（5′→3′） |
扩增片段
(bp) |
PCR退火
温度(℃) |
DGGE
温度(℃) |
变性梯度范围
(%) |
电压
(V) |
电泳时间
(h) |
| 13-1 |
CCAGATCTCTCTTCTGTCT GCAGTAAGATTGAACTCTT |
364 |
50 |
52 |
40-70 |
70 |
15 |
| 13-2 |
CTCAATTCTTCCACAGCAG
AACCAGTGTCTTGGCTAG |
332 |
48 |
54 |
40-70 |
80 |
15 |
| 13-3 |
GACACTGGTTCTCCTTCC GGATTATTTCATAGCATCCT |
230 |
48 |
54 |
40-70 |
70 |
16 |
| 13-4 |
GATGGCATTTGGCTTCTGA GTCTTAATGAGAAACTGGCT |
290 |
48 |
55 |
40-70 |
70 |
15 |
| 13-5 |
GTTTCCTAGAGTTAGACATAA
CTGATTGAGGTCTGTGGG |
293 |
48 |
54 |
40-70 |
80 |
15 |
| 13-6 |
CAGAAAGAAGACTTAAGCAT
GGGAAGGACTTGTGACTT |
362 |
48 |
54 |
40-70 |
70 |
16 |
| 13-7 |
GAACTCATTCAGAGAAACC
GTTGTATGGCTGAGGTCT |
243 |
55 |
54 |
40-70 |
70 |
15 |
| 13-8 |
AACTCAGCCATATGACTCT GGAATTTGACTGAGATCTG |
353 |
48 |
55 |
40-70 |
70 |
16 |
| 13-9 |
AGAACTCAGTCAGACAAAC CTGGATAAGGAAAAGACTC |
366 |
48 |
54 |
40-60 |
70 |
15 |
| 13-10 |
CTACCCTTCTGAATCTAGT
GGTACCATGCTGCAATGT |
363 |
49 |
54 |
40-70 |
80 |
16 |
| 13-11 |
CAAAACTGATGTTAGGACAA
AAATGAGAATAAAAAAGGAGAA |
221 |
47 |
54 |
40-70 |
70 |
15 |
注：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCGC-3′表2为13号外显子PCR引物序列及DGGE反应条件符号表示40-bp GC夹
5.变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析：应用D GENETM System(Bio-Rad公司)，DGGE条件为聚丙烯酰胺凝胶浓度为7.5%，变形剂浓度梯度范围为40%～70%（40%甲酰胺加7 mol/L尿素为100%变性剂浓度），电泳温度50～60℃，电压70V，电泳时间16～18 h。DGGE结果见图1。
注：条带1,4,6和8为A1628纯合子；条带2和10为G1628纯合子；条带3,5,7和9为1628 G→A杂合子
1 FV 10号外显子DGGE结果
6.受检PCR片段的测序：在DGGE电泳中发现异常条带，将条带割下，溶于双蒸水中，用同样条件进行PCR扩增。PCR产物经QIA quick试剂盒纯化（德国QIAGEN公司），纯化后，在ABI377测序仪上进行直接测序。10号外显子测序结果见图2。
注：上图的箭头所指为G1628，下图的箭头所指为A1628
2 FV 10号外显子测序结果
7.APCR测定：取受检血液、APTT试剂各0.05 ml混匀，温育2 min；加入0.025 mol/L氯化钙溶液0.05 ml，温育3 min，计算凝血时间，需作正常对照；APC-APTT测定：将APC-氯化钙溶液替代氯化钙溶液，余皆同APTT测定；APC比值计算：APC比值=APC-APTT值/APTT值；APC校正比值计算：APC比值(受检者)/APC比值(测定100例健康人混合血浆所得)。
8.FV活性测定：取受检血液5 μl，经缓冲液45 μl稀释后加入乏FV因子血浆50 μl；加入PT 试剂100 μl，计算凝血时间。
结果
1.CHD组和正常对照组的临床及实验室资料：见表3。
表3 冠心病组和对照组临床及实验室资料(x±s)
| 参 数 |
对照组(145例) |
CHD组(141例) |
稳定型心绞痛(83例) |
陈旧性心梗(58例) |
| 平均年龄(岁) |
56.5±6.25 |
64.8±7.73# |
64.8±7.48 |
64.6±7.91 |
| BMI(kg/m2) |
25.12±2.75 |
26.23±3.41 |
24.78±4.28 |
25.52±3.05 |
| 吸烟(例) |
— |
48 |
18 |
40 |
| 高血压(例) |
— |
30 |
25 |
14 |
| 血糖(mmol/L) |
5.35±0.48 |
6.25±2.14* |
6.21±2 |
6.30±1.89 |
| TC(mmol/L) |
4.61±0.87 |
4.74±0.96# |
4.74±0.96 |
4.74±0.97 |
| TG(mmol/L) |
1.38±0.62 |
1.46±0.68 |
1.49±0.7 |
1.43±0.61 |
注：与对照相比，* P＜0.01，# P＜0.05
2.PCR-DGGE发现5个FV基因多态性，并经测序证实：2号外显子中327 A→G(Gln51)，4号外显子中642G→T(Ser156)，10号外显子中1628G→A (Arg→Lys)，16号外显子中5380 G→A(Val→Met)，13号外显子4070A→G (His1299Arg) 。其中2号外显子的327 A→G(Gln51)为首次报告。另外，1628G→A导致氨基酸置换Arg→Lys，在141例CHD患者和145例正常对照之间多态频率差异有显著性(P＜0.01），10号外显子1628G→A等位基因频率(对照组0.79/0.21；CHD组0.64/0.36)。本研究的上海地区人群中，随机对55例CHD和55例健康者进行FV活性和APCR检测发现，FV活性二者比较无差异，但CHD患者APCR校正比值在健康者-稳定性心绞痛-陈旧性心梗患者逐渐降低，呈现APCR增强趋势，CHD组APCR发生率显著高于对照组(P＜0.05)，不同基因型FV活性及APCR比较见表4。
表4 冠心病组及正常对照组FV因子活性及APC比较
| 组 别 |
基因型 |
FV活性(x±s) |
APCR校正比值(x±s) |
APCR例数 |
| 例 |
% |
| 冠心病组 |
GG (n=20) |
101.44±21.52 |
1.47±0.39 |
2 |
10.0 |
| |
GA (n=22) |
101.39±21.98 |
1.22±0.29* |
4 |
18.2 |
| |
AA (n=13) |
102.15±32.21 |
1.20±0.32* |
2 |
15.4 |
| 正常对照组 |
GG (n=30) |
109.28±12.16 |
1.39±0.61 |
2 |
5.0 |
| |
GA (n=22) |
107.72±18.46 |
1.33±0.25 |
1 |
3.3 |
| |
AA (n= 3) |
87.50±14.78△ |
1.26±0.63 |
1 |
33.3 |
注：GA和AA基因型与GG相比，APCR校正比值极显著降低，* P＜0.01，△：AA基因型，P＜0.01
讨论
FV基因位于1q21-25，其蛋白结构有6个结构域：3个A区、1个B区和2个C区，排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2［2］，每一A区结构域含有一个由26个氨基酸残基组成的α环。另外，FV有7个半胱氨酸形成的二硫键，其中3个位于α环上：即α1环(139-165)、α2环（472-492）和α3环（1697-1723），这些二硫键区域均高度保守。
许多研究发现，FV Leiden突变与冠心病、心肌梗死发病存在相关性，但FV Leiden突变主要分布于欧洲人群，在亚洲人群中几乎不存在［6］。我们在141例CHD患者和145例健康对照组中也未发现到Leiden突变，但发现了5个FV基因多态性，其中2号外显子的327 A→G(Gln51)为国内外首次报告。统计表明在CHD组和健康对照组之间1628G→A(Arg485Lys)多态频率差异有极显著性，血清学检查发现Arg485Lys与APCR密切相关，其中，A等位基因与APCR相关，说明此多态性与冠心病发病有关，可能是冠心病的重要危险因素之一。该氨基酸置换位点位于A2结构域内和α2环上，毗邻APC灭活FV的位点(Arg506)，推测1628G→A(Arg→lys)可能一定程度上改变了特定区域的空间构象，使APC灭活FV受到影响，导致APC抵抗，从而对冠心病的发生发展起促进作用。这些假设有待进一步研究证实。
基金项目：上海市科委重大课题资助(974119003)
作者单位：龚兰生（上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科 200025）
参考文献：
1 Meade TW, Mellows S, Brozovic M, et al. Haemostatic function and
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