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NO对大鼠睡眠-觉醒的调节

NO对大鼠睡眠-觉醒的调节

中国应用生理学杂志 2000年第4期第16卷 研究论文

作者:张文慧 孙碧英 林殷利

单位:上海第二医科大学生理教研室,上海 200025

关键词:侧脑室微量注射;L-NAME;L-精氨酸;睡眠-觉醒;NO

  摘要 目的和方法:通过对大鼠侧脑室微量注射NOS抑制剂L-NAME及NO的前体L-精氨 酸(L-Arg)观察两种物质对大鼠睡眠-觉醒的影响。结果:注射1 mg L- NAME(5 μl)后4 h觉醒(W)明显增加,尤以注射后第1~2 h显著;4 h慢波睡眠(SWS)明显减 少,该效应同样以注射后第1~2 h显著;异相睡眠(PS)无明显变化。小剂量L-NAME(0.2 mg,5 μl)对大鼠的W、SWS、PS无明显影响;同样方法注射NO前体L-Arg 300 μg/5 μl 3~4 h后W明显减少而SWS显著增加;大鼠侧脑室注射L-Arg(300 μg/5 μl)+L-NAME(1 mg/5 μl)后,W、SWS及PS无明显变化。结论:L-NAME通过抑制NOS使 大鼠W增加,SWS减少,这一作用可被NO前体L-Arg所拮抗,说明NO参与了机体睡眠-觉醒的 调节。

  中图分类号: R338.63文献标识码:A

  文章编号:1000-68 34(2000)04-0339-04

THE REGULATION OF NO ON

  SLEEP-WAKEFULNESS IN RATS

ZHANG Wen-Hui SUN Bi-ying LIN Yin-li

  (Department of Physiology,Shanghai Second Medical University,Shan ghai 200025)

  ABSTRACT  Aim and Methods:The effects of an inhibitor of nitric oxide synthase L- NAME and a precursor of NO(L-arginine) on sleep-wakefulness in rats were exami ned. Results: ① The time of waking was increased(P<0.01) a nd the time of SWS was decreased(P<0.01) during the first two hours after in jection intracerebroventricularly(i.c.v.) of L-NAME 1 mg,this effect was showed across the 4 h recording period(P<0.05).The i.c.v. injection of L-NAME 0.2 mg had no significant effect.② The time of waking was su-ppressed during the third and fourth hours after i.c.v.injection of L-arginine 300 μg(P<0 .05).At the same time the increase of SWS was observed (P<0.01).③There was no change on W,SWS,PS when L-NAME 1 mg was given after administration of L-arg inine.Conclusion: The excitatory effect of L-NAME on wakefulness is mediated by inhibition of NOS.This effect could be antagonized by L-arginine . It suggests that NO is involved in regulation of sleep-wakefulness.

  KEY WORDS: injection intracerebroventricularly; L-NAME;  L-arginine; sleep-wakefulness; NO

  近年来大量研究表明,NO作为一种神经信使在中枢和外周发挥特有的生理效应。在中枢 神经系统存在大量NOS[1],体内NO可由L-精氨酸(L-Arg),在NO合酶(NOS)的作用 下转化而成。NO产生后可激活鸟苷酸环化酶而使cGMP水平上升,最终产生平滑肌舒张等一系 列作用。到目前为止,一些实验发现中枢神经系统内NO对机体的睡眠-觉醒也有影响,但具 体的作用尚不十分肯定,如Dzoljic和DeVries[2]腹腔注射NOS抑制剂L-NMMA发现L -NMMA对大鼠的觉醒具有抑制作用,从而提出中枢神经系统中NO对机体的觉醒有直接兴奋作 用。而Levente却认为NO可维持大鼠正常的睡眠-觉醒活动[3,4],尤其表现在有助 睡眠方面。本实验室多年来已掌握了一整套多导睡眠记录的方法,鉴于上述矛盾结果,我们 拟通过选用NOS抑制剂L-NAME及NO前体L-Arg对大鼠作侧脑室微量注射并记录大鼠睡眠-觉 醒周期,以期进一步探讨NO对大鼠睡眠-觉醒的确切影响。

  1 材料与方法

  1.1 动物手术

  实验采用SD雄性大鼠19只,体重200~300 g,1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉,将大鼠固定 于定向仪上,暴露颅骨,根据Paxinos和Watson图谱于左侧脑室(Ap-0.92,RL 1.6,H3 .7)插入微量注射用不锈钢外套管(Φ0.4 mm),内置比外套管长0.5 mm的不锈钢丝以防 脑脊液外流。分别于冠状缝前1 mm,右侧旁开2 mm,和矢状缝左右旁开3 mm,冠状缝后3~4 mm安置脑电电极,以不损伤硬脑膜为准;肌电电极由银丝制成,外套细塑料管以防互相干 扰,分别置于左侧颈部浅、深肌层和右侧颈深肌层;所有脑电、肌电电极和微量注射用外套 管均用磷酸锌粘固粉固定于颅骨表面,将脑电和肌电电极焊接到一插件上。术后大鼠自由活 动,饮食不限,分笼饲养于半隔音、恒温(22±2℃),工光照(6:00~18:00)的实验室中 。术后一周开始记录大鼠的脑电及肌电。脑电和肌电信号通过信号收集器输入8道脑电图机( 上海医用电子仪器厂出品)。

  1.2 微量注射用药物

  对照液为pH7.0的NS,L-NAME(sigma公司产品)以pH7.0的NS为溶剂,分别配置两种浓度 1 mg/5 μl和0.2 mg/5 μl,L-Arg(sigma公司产品)同样用pH7.0的NS配置,浓度为 300 μg/5 μl。

  1.3 侧脑室微量注射方法

  任大鼠自由活动,每次注射剂量5 μl。注射时拔去针芯,将微量注射管(Φ0.2 mm不锈 钢管)插入注射外套管,微量注射管通过细塑料管与5 μl微量注射器相连。注射缓慢,注射 完毕后留针约1 min,再次插入不锈钢内芯。注射于上午9:30开始,30 min内注射完毕,10 :00开始记录,连续记录4 h。每次实验随机注射NS或测试液。注射L-NAME 1 mg后一天不 作微量注射,但记录脑电及肌电2 h(10:00~12:00)以观察它的后作用。L-Arg和L-NA ME联合注射时先注射L-Arg 300 μg,15 min后再注射L-NAME 1 mg,同样30 min内注射 完毕。

  1.4 资料分析

  结合脑电和肌电分析大鼠睡眠-觉醒的3个时相。觉醒(W):脑电为低幅快波伴明显肌电; 慢波睡眠(SWS):脑电呈高幅慢波或梭形波,肌电明显减少或消失;异相睡眠(PS):脑电呈 有规律的波幅较一致的快波,肌电完全消失或仅偶有肌电活动。

  1.5 微量注射管定位鉴定

  实验结束后以0.9%生理盐水30~50 ml和10%福尔马林50~100 ml灌流取脑,脑组织浸 于10%福尔马林中固定。用半导体冰冻切片机将脑切成厚为25 μm的脑片,参照Paxinos和W atson图谱,借助光学显微镜判定微量注射管定位。

  1.6 数据处理

  累计每小时的W、SWS、PS的时间并按每2 h统计分析,另做4 h总和分析,数据用均数±标 准差(±s)表示,作同体实验前后比较的t检验。

  2 结果

  2.1 L-NAME对大鼠睡眠-觉醒的影响

  L-NAME 1 mg(n=8)注射后第1~2 h大鼠W显著增加(P<0.01),SWS显著减少 (P<0.01);注射后第3~4 h上述变化不明显;总计4 h的W明显增加(P<0.05), SWS明显减少(P<0.05);注射L-NAME 1 mg后大鼠的PS呈减少趋势(表1)。每次注射后 均见大鼠出现明显的兴奋症状。注射后一天脑电和肌电记录显示大鼠的W、SWS、PS基本恢复 正常。

Tab.1 Effect of L-NAME(1 mg,i.c.v.)on sleep

  and wakefulne ss(±s,n=8)

Group W SWS PS
1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total
Control 38.4±12.0 44.9±19.3  83.3±24.2 78.5±9.7 73.2± 18.3 151.7±22.5 3.0±4.4 2.1±4.7 5.1±8.1
L-NAME 66.3±

  19.7**

58.2±21.1 124.5 ±36.9* 53.3±19.5** 61.5±21.0 114.8±36.6* 0.25±0.7 0.25±0.7 0.5±0.9

  *P<0.05, **P<0.01 comp ared with NS group  实验结果显示L-NAME 0.2 mg(n=9)对大鼠的W、SWS、PS无明显影响(表2);注射后无 明显行为变化。

Tab.2 Effect of L-NAME(0.2 mg,i.c .v.)on sleep

  and wakefulness(±s,n=9)

Group W   SWS   PS  
1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total
Control 44.6±18.4 46.0±19.3 90.4±31.5 72.6±17.6 72.7±17.6 144.2±30.0 2.8±3.3 2.6±4.7 5.1±7.5
L-NAME 40.0±12.9 37.1±14.8 77.1±24.4 78.7±12.9 78 .7±13.5 156.9±22.7 1.3±2.0 1.2±1.8 2.6±3.8

  2.2 L-Arg及L-Arg+L-NAME对大鼠睡眠-觉醒的影响

  注射L-Arg 300 μg(n=4)后第1~2 h和总计4 h的W、SWS、PS变化不明显,但注 射后第3~4 h可见W明显减少(P<0.05),SWS显著增加(P<0.01),PS无明显变化 。联合注射L-Arg 300 μg和L-NAME 1 mg(n=4)后大鼠的W、SWS无明显变化,PS也无 明显变化,未见到单独注射L-NAME 1 mg后所引起的W增加而SWS减少的效应(表3)。

Tab.3 Effect of L-Arg(300 μg,i.c.v)and

  L-Arg+L-NAME(1 m g,i.c.v.)on sleep

  and Wakefulness(±s,n=4)

Group W SWS PS  
1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total 1~2 h 3~4 h Total
Control 59.6±20.4 66.5±8.6 126.1±16.7 56.0±17.7 51.6±7.4 107.6±12.1  4.4±3.8 1.9±2.8 6.3±5.7
L-Arg 62.5±16.6 49.9±4.9* 112.3±18.3 57.3±16.1 67.5 ±6.5** 124.8±18.7 0.25±0.5 2.6±2.6 2.9±2.5
L-Arg+

  L-NAME

59.0±31.0 55.4±10.3 114.4±39.6 59 .6±30.3 64.3±10.0 123.9±38.8  1.4±1.7 0.4±0.8 1.8±2.4

  *P<0.05, ** P<0.01 compare d with NS group2.3 微量注射管定位

  实验后参照Paxinos和Watson图谱在光学显微镜下观察微量注射管定位基本准确。

  3 讨论

  本实验通过侧脑室微量注射NOS抑制剂L-NAME后发现,大剂量L-NAME(1 mg)引起大鼠 觉醒(W)增加,慢波睡眠(SWS)减少,异相睡眠(PS)呈减少趋势;这一效应尤以注射后第1~2 h显著,并持续4 h。但注射后第二天大鼠的睡眠-觉醒周期基本恢复正常。这一实验结果 与Levente Kapas等[3]实验结果相一致。他们给大鼠脑室注射L-NAME 1 mg后同 样发现注射后头2 h SWS明显减少,分别减少了67%和40%,而且这一作用在注射后6 h一直 存在。已经证明,在中枢神经系统内很多与睡眠有关的中枢结构均有NOS[5],如 下丘脑,嗅结节,中脑,脑桥被盖区等,所以我们认为L-NAME对大鼠睡眠-觉醒的影响可 能是通过抑制脑内与睡眠有关的神经元内NOS造成内源性NO减少所致。我们在注射小剂量L- NAME(0.2 mg)后发现大鼠的睡眠-觉醒周期并无明显改变,这说明L-NAME对大鼠的睡眠 -觉醒的调节具有剂量-效应关系。

  为了进一步证实上述推断,我们又在侧脑室内注入NO前体L-Arg,也联合注射L-Arg和 L-NAME,以观察大鼠的脑电和肌电变化。尽管有认为在正常条件下L-Arg并不改变机体 的睡眠-觉醒周期,如Dzoljic等脑室注射L-Arg后并未出现大鼠睡眠-觉醒的变化[2 ],但我们在实验中发现,侧脑室微量注射L-Arg 300 μg后第3~4 h大鼠W明显减少而S WS显著增加,而注射后第1~2 h及总计4 h的W、SWS无明显变化,PS基本不受影响。这一结 果与注射L-NAME引起SWS减少的作用相符。Levente 等也曾于脑室微量注射NO的供体SNAP 和SIN-1,结果注射NO供体后大鼠睡眠增加[6,7]。上述脑室注射L-Arg的结果和 Dzoljic等的实验结果不同,可能与注射的浓度不同有关。当我们联合注射L-Arg和L-NAME 时,注射后头2 h和整个4 h大鼠的W、SWS、PS均无明显变化,而单独注射L-NAME时,在上 述时段中大鼠的W、SWS有明显改变。这说明L-Arg和L-NAME的作用互为拮抗。以上的实验 结果进一步说明L-NAME最终是通过减少脑内NO而产生致觉醒作用,由此我们得出如下结论 即中枢神经系统内NO参与了睡眠-觉醒的调节。

  那么NO究竟是通过何种机制来发挥它的调节作用的呢?有认为NO可通过脑内温度的改 变而影响机体的睡眠-觉醒周期。文献认为NO可刺激基底前脑释放Ach[8],而基底 前脑、中脑以及脑桥内的胆碱能系统又与机体慢波睡眠及异相睡眠有关[9]。此外 还有报道提出NO可影响大鼠纹状体内源性多巴胺的释放,而多巴胺也是影响机体睡眠-觉醒 周期的一个重要因素。尽管以上观点已得到某些实验的支持,但NO的作用机制到目前为止还 不十分清楚。

  总之,我们的工作表明L-NAME可抑制大鼠的SWS,使其W增加,这一作用可被L-Arg所阻 断,提示NO参与了正常睡眠-觉醒活动的调节。

  作者简介:张文慧(1966-),女,江苏句容,讲师,从事睡眠机制研究 。

  4 参考文献

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收稿日期:1998-12-04

  修回日期:2000-06-22


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