5-HT_1A和5-HT₂受体功能与觉醒、睡眠成分关系的研究

　　中国药理学通报2000年第16卷第2期

靳照宇　库宝善　姚海燕　李中华　饶煜

　　摘　要　目的　观察5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT和HT₂受体拮抗剂利坦色林(ritanserin)对大鼠清醒和睡眠成分的影响，给予5-HT_1A受体激动剂和剥夺REM睡眠后皮层5-HT₂受体结合能力的变化，进一步分析两种5-HT受体亚型之间的关系以及5-HT₂受体在睡眠中的作用。方法　利用大鼠睡眠自动分析系统定量分析清醒和睡眠成分的变化，注射PCPA制作剥夺睡眠的大鼠模型，水上平台法制作剥夺REM睡眠的大鼠模型，利用放射配体结合实验研究配体与受体结合力的变化。结果　8-OH-DPAT小剂量（0.01 mg·kg^-1, sc)可以增加深睡眠和浅睡眠，减少觉醒；大剂量（0.375 mg·kg^-1, sc）则增加觉醒，减少全部睡眠成分。5-HT₂受体拮抗剂ritanserin可以明显增加深睡眠，减少觉醒和REM睡眠。而8-OH-DPAT低剂量与ritanserin联合用药则使深浅睡眠明显增加，清醒和REM睡眠明显减少，具有协同作用。对于PCPA化使3种睡眠成分均明显减少，觉醒比例明显增加的大鼠，ritanserin仅使浅睡眠增加其它成分不变。用［³H］-ritanserin放射性配基结合显示，剥夺大鼠REM睡眠后皮层5-HT₂受体B_max值明显增加但K_d值无变化；给予5-HT_1A激动剂8-OH-DPAT后皮层5-HT₂受体K_d和B_max均降低。结论　5-HT_1A受体和5-HT₂受体与睡眠有密切关系，两种受体亚型之间也有一定联系，轻度激动5-HT_1A受体或拮抗5-HT₂受体均可增加深睡眠，同时激动和拮抗这两种亚型受体在减少REM睡眠和增加深睡眠方面具有协同作用，而减少REM睡眠显然在临床上是不利的。

　　关键词：5-HT_1A受体　5-HT₂受体　激动剂　拮抗剂　睡眠自动分析系统　睡眠成分

　　5-HT是一种重要的中枢神经递质，参与多种行为、情绪活动尤其是睡眠的调节。随着新的5-HT受体亚型克隆成功和一些作用更专一的激动剂、拮抗剂的出现，为研究5-HT受体的功能提供了方便。据报道，5-HT₁与5-HT₂受体共同存在于中枢神经系统某些部位，共同调节某些生理功能。早期研究发现5-HT₂拮抗剂可以明显增加深睡眠，激动5-HT₁受体也能影响睡眠。本研究主要目的一则是确定5-HT_1A和5-HT₂受体亚型与睡眠（特别是深睡眠）的关系，二则是探讨能否通过联合用药来更有效地改善睡眠。为此，我们利用5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT、5-HT₂受体拮抗剂利坦色林（ritanserin）研究了它们对睡眠的影响，及联合用药的效果。利用放射配体结合实验分析了大鼠剥夺REM睡眠和给予5-HT_1A激动剂后，皮层5-HT₂受体特异结合的变化。

　　1　材料和方法

　　1．1　动物　♂ Wistar大鼠，体重300～400 g，北京医科大学实验动物中心提供，在睡眠研究室内分笼饲养，食水自由。明暗周期12 h/12 h。室温(20±2)℃。

　　1．2　仪器和材料　SN-2型脑立体定位仪，日本Narishige科学仪器实验室产品；NEC362八导生理记录仪，日本NEC三荣公司生产；模-数转换板(A/D板)，北京祥云计算机公司生产, a/D板型号p-1216k1,12位16通道，转换时间8.5 μs，转换误差＜0.2％；486PC机；高速低温离心机（美国Beckman, J2-21型）；液闪测定计数仪（美国Beckman,DP5500型）； 721分光光度仪（Perkin-Elmer公司）；恒温水浴槽（Forma scientific公司）；液体快速混合器（江西医疗器械厂，YKH-I型）；真空抽滤器（美国Milipore公司产品）。

　　1．3　药品及试剂　戊巴比妥钠：佛山市化工实验厂产品，临用前用蒸馏水配制成30 g·L^-1溶液。利坦色林（ritanserin）：美国RBI公司产品，临用前用酒石酸溶液配制。8-OH-DPAT：美国RBI公司产品，临用时以生理盐水溶液配制。螺哌隆（spiperone）：北京医科大学精神卫生研究所周东风教授馈赠，用体积分数为10％乙醇配制。PCPA：Sigma公司产品，临用前用以弱碱性溶液配制。［³H］-ritanserin：美国Dupont公司产品，2.22～3.33 pBq*mol^-1, 临用时用体积分数为10％乙醇配制。Foline酚，北京医科大学生物化学系馈赠。牛血清白蛋白（BSA），上海生物化学研究所产品。2,5-二苯基口　恶唑（PPO）和1,4-双-2-(5-苯基口　恶唑)(POPOP)，北京生化技术公司产品。三羟甲氨基甲烷（Tris），北京华美生物制品公司产品。

　　1．4　方法

　　1．4．1　动物手术　♂ Wistar大鼠，戊巴比妥麻醉（30 mg·kg^-1，ip）后将头部固定于立体定位仪，无菌手术暴露颅骨，双氧水清洁颅骨表面，将4枚不锈钢表螺丝(直径2 mm)作为脑电极分别埋藏在前囟前2.0 mm后4.0 mm中线左右旁开2.0 mm处；用细铜丝做成肌电极和眼电极，其中两肌电极埋藏于颈深部肌肉，两个眼电极埋藏于大鼠一侧眼内外眦。将这些电极连接到一个九孔插座上，最后用牙托粉封固在颅骨上。术后给抗生素3 d，恢复两周选择脑电稳定者用于实验。

　　1．4．2　给药及大鼠睡眠记录和分析　记录前适应环境2 d，使之建立起正常昼夜睡眠觉醒周期。重复给药至少间隔5 d，以保证前一种药物作用消失。给药剂量是依据相关文献报道及本研究预实验结果。每只大鼠结果采用给药前后自身对照。每日10：00～16：00 h进行记录，应用大鼠睡眠自动分析系统进行清醒和睡眠成分的定量分析（以所占总记录时间的百分比表示）。

　　1．4．3　放射配体结合实验　皮层受体蛋白组织制备：大鼠迅速断头，冰浴下取出前脑皮层，称重，加入20倍体积的孵育缓冲液（pH＝7.6），匀浆。取2 ml匀浆液在4℃离心45 000×g，15 min。弃上清，加入冲洗缓冲液，4℃下45000×g离心，15 min，弃上清，加入孵育缓冲液，37℃水浴预孵育10 min。重复匀浆、离心过程2遍。用pH 7.0冲洗缓冲液制成400倍体积匀浆。每管取200μl待用(Yoneda et al, 1987)。5-HT₂受体分析： 皮层粗膜上5-HT结合位点用［³H］-ritanserin定量测定。200μl 组织液中加入［³H］-ritanserin 20 μl，在分别加入和不加spiperone(5 mmol·L^-1) 20 μl，液闪计数法测定结合力。非特异结合力即高浓度spiperone下的结合力，特异结合力为总结合力减去非特异结合力。将［³H］-ketanserin的浓度与特异结合值进行Scatchard分析，可求出［³H］-ritanserin结合的K_d和B_max。Lowry法测定大鼠皮层受体蛋白浓度（林志彬,1992)。

　　1．4．4　水上平台法剥夺大鼠的REM睡眠　平台直径为4.5 cm，高出水面1 cm。睡眠剥夺24 h，每8 h之间有20 min自由食水时间(李德明, 1981)。

　　2　结果

　　2．1　5-HT_1A、5-HT₂亚型受体与睡眠的关系　不同剂量的5-HT_1A激动剂8-OH-DPAT（sc）,5-HT₂受体拮抗剂ritanserin（ip）,以及二者联合用药对于大鼠清醒及睡眠成分的影响，结果见表1。

　　结果发现低剂量8-OH-DPAT（0.01 mg·kg^-1 ，sc）可以明显减少清醒比例，增加浅睡眠和深睡眠比例，而不影响REM睡眠比例。高剂量8-OH-DPAT（0.375 mg·kg^-1，sc）可以明显增加清醒比例，减少浅睡眠、深睡眠和REM睡眠的比例。ritanserin（0.63 mg·kg^-1,ip）可以明显增加深睡眠，减少REM睡眠,而清醒和浅睡眠没有改变。低剂量8-OH-DPAT（0.01 mg·kg^-1,sc）与ritanserin（0.63 mg·kg^-1,ip）联合给药可以更明显的增加深睡眠和浅睡眠比例，而清醒和REM睡眠则明显减少，有一定的协同作用。

　　2．2　ritanserin对PCPA化大鼠睡眠时相的影响　证明了5-HT₂受体拮抗剂ritanserin在正常大鼠可以明显增加深睡眠和减少REM睡眠，现在研究它对化学性剥夺睡眠大鼠的影响。连续2 d给大鼠注射PCPA（400 mg·kg^-1 ，ip）造成剥夺睡眠大鼠模型，给ritanserin（0.63 mg·kg^-1，ip）后观察清醒和睡眠成分的变化，结果见表2。

Tab 1　Effects of8-OH-DPAT(sc),ritanserin（ip）and combination of both on waking and sleeping stages in rat（10:00～16:00,%,X±s,n=10）

　　SWS：slow wave sleep；REM：rapid eye movement （sleep）；^*P＜0.05, ^**P＜0.01 vs control

Tab 2　Effects of ritanserin on waking and sleeping stages in rat deprived sleeping with PCPA （10:00～16:00,%,X±s,n=6）

　　^**P＜0.01 vs control；^△△P＜0.01 vs PCPA　　从结果可以看出，PCPA连续2 d腹腔注射，使大鼠各种睡眠成分均明显减少，而清醒成分明显增加，呈睡眠剥夺状态。对这种PCPA化的大鼠腹腔注射ritanserin只能一定程度恢复浅睡眠，而其它睡眠成分无明显变化。说明ritanserin在正常大鼠引起的深睡眠增加和REM睡眠的减少主要依赖于5-HT的存在。

　　2．3　激动5-HT_1A受体和剥夺REM睡眠后对皮层5-HT₂受体配体结合的影响　在皮下注射高剂量（0.375 mg·kg^-1）或低剂量（0.01 mg·kg^-1）5-HT_1A激动剂8-OH-DPAT1 h后，以及水上平台法剥夺大鼠REM睡眠24 h后，制备皮层受体蛋白，用［³H］-ritanserin作配体进行5-HT₂受体结合实验，所获结果进行Scatchard分析并计算［³H］-ritanserin在上述两种条件下与5-HT₂受体结合的K_d值和B_max值，结果见表3。

Tab 3　Effects of 5-HT_1A agonist and depriving REM

　　sleep on binding capacity of ［³H］-ritanserin （as a

　　ligand of 5-HT₂ receptor ） in cortex of rat（X±s,n=6）

　　（-）or（＋）,compared with control decreasing or increasing（%）　　从结果可以看出，皮下注射低剂量8-OH-DPAT使大鼠皮层5-HT₂受体K_d和B_max值分别下降53％和30％；高剂量8-OH-DPAT使大鼠皮层5-HT₂受体K_d和B_max值分别下降51％和45％。说明激动5-HT_1A受体对5-HT₂受体数有一定的下调作用，但使亲和力增加（1/K_d）。在REM睡眠剥夺大鼠，5-HT₂受体配体结合的K_d值无明显变化，而B_max值增高52％，说明剥夺REM睡眠对5-HT₂受体的亲和力影响较小，主要使受体数目增加。

　　3　讨论

　　研究清醒和睡眠成分的受体机制有重要的生理学意义和药理学价值。早期研究表明5-HT在睡眠调节中起着重要作用。用PCPA抑制脑内5-HT合成或电损伤中缝核，均可引起动物严重失眠(Jouvet m， 1984)。但长期给PCPA尽管5-HT保持低水平，睡眠仍可以恢复(Dement wC et al， 1972)。

　　近年来开发出几种5-HT受体亚型选择性激动剂、拮抗剂，又激发起人们重新研究睡眠与5-HT受体亚型的关系。放射自显影表明，大鼠前脑皮层的特殊层同时存在5-HT_1A和5-HT₂受体，而电生理研究也证明大鼠前脑V层锥体神经细胞上也有5-HT_1A和5-HT₂两个受体亚型存在。最近离体研究表明在中脑网状结构与REM睡眠有关的神经元，5-HT₂激动后超极化，5-HT_1A受体激动后去极化。5-HT_1A和5-HT₂受体均参与体温调节，但作用相反。

　　Jaime M et al （1994) 报道蛛网膜下腔注射8-OH-DPAT可能激动脊髓5-HT_1A受体，减弱感觉传导，通过减弱网状结构上行激活系统增加睡眠。本研究证明小剂量8-OH-DPAT增加深睡眠和浅睡眠，明显减少清醒的比例，对REM睡眠无影响；大剂量则明显增加清醒，减少各种睡眠成分。

　　现认为5-HT₂ 受体与睡眠关系较为密切。5-HT₂激动剂可以引起睡眠减少，而5-HT₂拮抗剂可以引起睡眠增加。ritanserin是5-HT₂受体拮抗剂中选择性较强，亲和力较高的一种，容易通过血脑屏障。在大鼠0.63 mg·kg^-1（ip）ritanserin对睡眠影响最明显，可占据前脑皮层80％的5-HT₂受体结合位点,剂量再加大虽然占据位点增多，但也开始影响其它受体如H₁受体，故本研究采用0.63 mg·kg^-1 ip 剂量(Leysen et al, 1985)。本实验结果与jorvatn bB and Ursin R（1990）的报道很一致，即给予5-HT₂拮抗剂ritanserin后大鼠深睡眠明显增加，REM睡眠明显减少。

　　有人认为ritanserin调节睡眠可能是间接影响血压或体温来实现的，但更多的研究则予以否定（Awouter f et al, 1988)。

　　低剂量5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT和5-HT₂受体拮抗剂ritanserin联合使用对睡眠成分的影响，尚未见有报道，本研究联合应用目的是为了揭示在睡眠调节过程中，尤其是在深睡眠（SWS）的调节过程中，5-HT_1A和5-HT₂受体体之间是否可能有协同关系。以往有研究表明低剂量8-OH-DPAT激动5-HT_1A受体后脑电波功率谱变化与拮抗5-HT₂受体后的变化极为相似，它们改变睡眠的模式也很相似。低剂量8-OH-DPAT的作用部位是突触自身受体，这有可能通过减少5-HT释放起到类似拮抗5-HT₂受体起作用（Jaime m et al，1994)。本研究结果显示联合应用低剂量8-OH-DPAT和ritanserin后，清醒和浅睡眠成分变化类似于单独给小剂量8-OH-DPAT，深睡眠成分比单独应用ritanserin略有增加，REM睡眠则是极明显减少。REM睡眠的减少显然于临床用药不利，因为REM睡眠成分具有不可压缩性，否则停药后会引起强烈“反跳”现象。

　　联合应用的结果提出了这样一个问题，即激动5-HT_1A受体或剥夺REM睡眠后会对5-HT₂受体有什么影响。对此本研究利用配体结合实验进行了初步探讨。结果显示，不论低剂量还是高剂量的HT_1A激动剂8-OH-DPAT均可降低5-HT₂受体与配体结合的B_max，并增加结合的亲和力；剥夺REM睡眠不影响与配体结合的亲和力，而增加配体结合的B_max。

　　综合本研究的结果发现一有趣的现象：拮抗5-HT₂受体后REM睡眠比例明显减少，加用小量5-HT_1A受体激动剂后使5-HT₂受体配体结合B_max降低的同时REM睡眠比例减少更加明显，而剥夺REM睡眠后则使B_max明显升高。这提示5-HT₂受体数与REM睡眠所占比例之间有明显关系。

　　作者简介：靳照宇，男，26岁，医学硕士；库宝善 ，男，54岁，教授，药学系主任靳照宇（北京医科大学药理学系， 北京　100083)

　　库宝善（北京医科大学药理学系， 北京　100083)

　　姚海燕（北京医科大学药理学系， 北京　100083)

　　李中华（北京医科大学药理学系， 北京　100083)

　　饶煜（北京医科大学药理学系， 北京　100083）

　　参考文献

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　　3．Gudelsky GA, Koenig JI, Mwltzer HY. Thermoregulatory responses to serotonin(5-HT) receptor stimulation in the rat: evidence for poopsing roles of5-HT₂ and 5-HT_1A receptor. Neuropharmacology,1986; 25:1307～13

　　4．Jaime M, Monti JM. Depletion of brain serotonin by 5,7-DHT: effects on the8-OH-DPAT-induced changes of sleep and waking in the rat. Psychopharmacology,1994;115:272～7

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　　6．Leysen J. Receptor binding properties “in vitro” and “in vivo” of ritanserin, a very potent and long acting serotonin-S2 antagonist. Mol Pharmacol,1985;27:600～11

　　7．Yoneda Y. Comparative study of ［³H］-glutamate binding sites in rat retina and cerebral cortex. Biochem　Pharmacol, 1987;36:772～4

　　8．李德明, 邵道生. 快速眼动相(REM)睡眠剥夺对大鼠记忆巩固的影响.心理学报,1981;2:226

　　9．林志彬主编. 高级药理学实验,北京：北京医科大学药理学系编，1992:4～5