副流感病毒兰州株的分离与鉴定
免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学
作者：段佩若 张容惠 杨春梅 韩洪彦 张励力 严冰 赵华
单位：段佩若（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）；张容惠（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）；杨春梅（兰州军区防疫队，甘肃 兰州 730020）；韩洪彦（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）；张励力（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）；严冰（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）；赵华（第二炮兵总医院临床实验科，北京 100088）
关键词：副流感病毒；血凝抑制免疫交互试验；呼吸道病毒单克隆抗体
［摘 要］ 目的 副流感病毒兰州株的分离与鉴定。方法 应用鸡胚和人胚肺成纤维突变细胞株分离病毒；应用血凝和血抑以及近年来多株流感国际和国家株（H1N1亚型6株、H3N2亚型2株、B型4株）作抗原抗体交互试验；还用4类主要呼吸道病毒单克隆抗体间接免疫荧光法与2株兰州株的病毒抗原基质片作特异性交叉反应。结果 2株兰州株在鸡胚中培养血凝效价滴度高达1∶512（＋＋）。它们与流感病毒甲型（H1N1和H3N2）以及乙型流感抗血清均无血抑反应。它们的血凝素抗原及血清与12株甲和乙型流感病毒株无免疫血抑交互反应。但2株流行株抗原片可和副流感病毒2型单克隆抗体发生较强反应，在人胚肺细胞中培养有明显细胞融合病变。结论 2株流行株虽具有高滴度血凝效价，但不是流感病毒株，根据单克隆抗体荧光染色和流行株在人胚肺细胞中的病变，初步确认为副流感病毒2型。
［中图分类号］ R375．1 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）05-0362-03
Identification of parainfluenza virus by using monoclonal antibody and immunoassay
DUAN Pei-rou ZHANG Rong-hui HAN Hong-yan ZHANG Li-li YAN Bing ZHAO Hua
（Department of Experimental Research，the General Hospital of the Second Artillery，Beijing 100088，China）
YANG Chun-mei
（Epidemic Prevention Team，Lanzhou Military Region，Lanzhou 730020，China）
［Abstract］ Objective To identify two epidemic strains of parainfluenza virus isolated from secreta of two soldiers in Lanzhou． Methods Viruses were isolated by using chicken embryo and mutant lung fibroblast （Z-HL-16C） of human embryo． The viruses isolated were assayed by hemagglutination （HA） test，hemagglutination inhibition （HAI） test and antigen-antibody cross test with several international and national influenza strains （4 substrains of H1N1，2 substrains of H3N2，4 strains of Flu B）．Virus antigen slides of them were also assayed by specific cross test with monoclonal antibodies（McAb） against 4 main respiratory track viruses．Results HA titer of two Lanzhou strains cultured in chicken embryo was high up to 1∶512（++）． The results of HAI test were negative when assayed with anti-sera of Flu A （H1N2 and H3N2） and FluB viruses．Negative results were also obtained in antigen-antibody cross test with 12 strains of FluA and FluB viruses．However，strong fluorescence were obtained when antigen slides of two Lanzhou strains were tested with PIV-2 McAb． Pathological changes of cell fusion were obvious in Z-HL-16C in which two Lanzhou strains were cultured． Conclusion The viruses isolated were not influenza viruses in spite of their high HA titer． We identified preliminarily them as PIV-2 type by results of McAb fluorescent staining and pathological changes in Z-HL-16C．
［Key words］ parainfluenza virus；hemagglutination inhibition test；monoclonal antibody against respiratory track virus
副流感病毒1、2、3型（parainfluenza viruses types1．2．3，PIV1．2．3），它们是人类急性呼吸道感染性疾病的主要病原体之一，可以引起小儿喘憋性肺炎和支气管炎，成人可以引起急性上和下呼吸道感染。其中副流感2型又是急性喉、气管、支气管炎的重要病原，成人的主要症状有咽肿痛、咳嗽和声哑。我国成人80％以上血清中有副流感病毒抗体，说明它在人群中流行的重要性。1998年10月，我们应用鸡胚分离流感病毒时，从2位流感样疾病战士的鼻咽部分泌物中，获得具有高滴度血凝效价的病毒株。经我们鉴定以及日本东京WHO流感中心协助鉴定，证实是2株副流感病毒株，此将鉴定结果报告如下：
1 材料与方法
1．1 标本来源 2株病毒标本均源于1998年10月兰州某部2位急性呼吸道感染战士咽拭子标本。标本采样后立即浸入肉汤中，待分离病毒。
1．2 病毒分离与鉴定
1．2．1 鸡胚分离病毒：2份咽拭子标本按常规法处理［1］，每份标本接种在3个9 d龄鸡胚内，置34 °C 72 h后，移4 °C冰箱过夜，分别取尿囊腔液和羊膜腔液，作血凝试验和血凝抑制试验。
1．2．2 人胚肺成纤维细胞突变株（Z－HL16C）分离病毒：按文献［2］将鸡胚尿囊腔液接种3瓶Z－HL16C细胞培养液中，置34 °C培养，待细胞发生病变，制成细胞病毒抗原片，以丙酮固定备用。
1．2．3 流行株抗原与主要呼吸道病毒单克隆抗体的交叉特异性鉴定：抗鼠荧光IgG和系列单克隆抗体来源：抗鼠荧光IgG由军事医学科学院5所制备，效价为1∶7；呼吸道病毒单克隆抗体由本实验室制备［3］，分别用流感甲（FluA）和乙（FluB）、合胞病毒（RSV）、腺病毒（Adv）以及副流感病毒1、2、3型（PIV1．2．3）单克隆抗体进行免疫间接荧光染色［4］。
1．3 鉴定用的毒株和相应抗血清来源
1．3．1 国家流感中心提供作血抑流感亚型的鸡抗血清：H1N1为A／桂防／10／94和A／京防／25／96；H3N2为A／沪防／1／98和A／汉防／359／95；B为B／北京／243／97和B／深防／12／97。
1．3．2 东京WHO流感协作中心提供作血抑免疫交叉试验的流感毒株和相应雪貂抗血清：H1N1为A／北京／262／95、A／拜恩州／07／95、A／约翰内斯堡／82／96、A／河北／04／97、A／莫斯科／10／99和A／日本／92／98。H3N2为 A／南昌／933／95和A／悉尼／05／97。B为B／北京／243／97、B／山东／07／97、B／北京／184／93、B／河北／07／94和B／日本／166／98。
1．4 流行株血凝素和抗血清制备 2株流行株鸡胚传代获得的尿囊腔液作为血凝素抗原。将抗原分别从静脉给健康莱亨鸡注入（鸡血清事先测定无流感抗体），7 d后试血和分离血清［1］。
1．5 血凝抑制试验 以购自流感中心的霍乱菌液，按常规法［1］破坏鸡血清中非特异抑制素，抗体测定按微量半加敏血凝抑制试验进行［1］。
2 结果
2．1 兰州病毒株血凝效价和血抑结果 以鸡胚传代两代，以鸡血球作血凝效价为1∶520以上，故怀疑是流感病毒株，用血抑法进行流感亚型鉴定，均为阴性。暂命名为兰州／4／98和兰州／5／98。
2．2 兰州株与多株流感毒株的抗原抗体交叉血抑试验
2．2．1 兰州株与甲1型流感亚型（H1N1）的血抑交互反应：兰州／4／98和兰州／5／98与6株H1N1代表株无任何反应（见表1）。
表1 兰州株与6株H1N1流感亚型毒株的血抑交互试验
Tab 1 HI test of Lanzhou／98 strains with 6 strains of H1N1 virus
| virus |
ferret anti-sera |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
| A／Beijing／262／95 |
640 |
40 |
＜10 |
320 |
40 |
160 |
| A／Bayern／07／95 |
20 |
640 |
320 |
＜10 |
640 |
10 |
| A／Johannesburg／82／96 |
20 |
640 |
640 |
＜10 |
1 280 |
40 |
| A／Hebei／04／97 |
80 |
＜10 |
＜10 |
640 |
80 |
20 |
| A／Moscow／13／98 |
20 |
320 |
320 |
20 |
1 280 |
40 |
| A／Japan／92／98 |
40 |
＜10 |
＜10 |
160 |
＜10 |
320 |
| Lanzhou／4／98 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
| Lanzhou／5／98 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
2．2．2 兰州株与甲3流感亚型（H3N2）的血抑交互反应：兰州株与2株H3N2不反应（见表2）。
表2 兰州株与2株H3N2流感亚型毒株的血抑交互试验
Tab 2 HI test of Lanzhou／98 strains with 2 strains of H3N2 virus
| virus |
ferret anti-sera |
| 1 |
2 |
| A／Nanchang／933／95 |
640 |
40 |
| A／Sydney／05／97 |
20 |
1 280 |
| Lanzhou／4／98 |
＜10 |
＜10 |
| Lanzhou／5／98 |
＜10 |
＜10 |
2．2．3 兰州株与4株乙型流感毒株的血抑交互反应：4株乙型流感毒株均不能与兰州株发生反应，仅兰州株的抗血清与兰州株本身血抑达320～1 280（见表3）。
2．3 兰州株与几种单抗的免疫荧光反应 2株兰州株仅和副流感单抗发生反应，而副流感2型单抗反应要强于副流感1和3型（见表4）。
表3 兰州株与4株乙型流感毒株的血抑交互试验
Tab 3 HI test of Lanzhou／98 strains with 4 strains of B virus
| virus |
ferret anti-sera |
chicken anti-sera |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
| B／Beijing／243／97 |
160 |
160 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
| B／Shandong／07／97 |
160 |
320 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
| B／Beijing／184／93 |
＜10 |
20 |
320 |
640 |
＜10 |
＜10 |
| B／Japan／166／98 |
20 |
＜10 |
80 |
640 |
＜10 |
＜10 |
| Lanzhou／4／98 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
320 |
1 280 |
| Lanzhou／5／98 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
＜10 |
320 |
1280 |
The results of Tab1，2，3 were adopted from the reports of WHO influenza center
表4 兰州株抗原与主要呼吸道病毒的交叉试验结果
Tab 4 FA cross test of Lanzhou／98 with McAbs against respiratory tract viruses
| virus |
McAb |
| RSV |
FluA |
FluB |
Adv3．7 |
PIV1．3 |
PIV2 |
| Lanzhou／4／98 |
－ |
－ |
－ |
－ |
+ |
++ |
| Lanzhou／5／98 |
－ |
－ |
－ |
－ |
+ |
++ |
mixed polyvalent PIV1．3-McAbs3 讨论
应用鸡胚作流感病毒分离工作，其阳性结果一般需传几代后血凝效价才能达到较高滴度。兰州／4／98和兰州／5／98只传两代血凝滴度就达1∶512以上，很容易让人怀疑是流感病毒，但经血凝和血抑以及多株血抑抗原抗体免疫交互反应试验鉴定不属于流感病毒株，又经单克隆抗体荧光染色，确认是副流感病毒株。
文献中论述，副流感2型病毒经鸡胚培养其羊膜腔液在4 °C反应时血凝滴度最高，病毒接种人胚肺细胞株病变特征是形成细胞融合［5］，2株兰州株完全符合以上特点，副流感1型和3型不具备以上特点。由于副流感1、3单克隆抗体是多株混合的，它与兰州株抗原有轻微交叉反应，我们认为，2株在4°C高血凝滴度的兰州株是副流感2型流行毒株。
流感病毒的流行有较强的季节性，而副流感病毒可以在一年内任何月份分离出来，我国有关副流感病毒分离的报导较少，日本1998年8月～2000年1月近一年半时间累计分离出PIV 134株（PIV1 44株，PIV2 44株，PIV3 46株）［6］，实际上副流感病毒在临床疾病上是很重要的，它不单是儿童呼吸道感染的主要病原，也是一些成人慢性病患者的重要病原［7，8］。
［基金项目］ 全军九五医学卫生科研基金资助项目（95－A011）
［作者简介］ 段佩若（1936－），女，河南开封市人，主任医师，大专，主要从事呼吸道病毒的研究。
［参考文献］
［1］ 郭元吉．流行性感冒［A］．见：黄祯祥，主编．医学病毒学基础及实验技术［M］．北京：科学出版社，1990.670－679.
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［3］ 段佩若，张励力，韩洪彦，等．抗8种主要呼吸道病毒单抗杂交瘤细胞库的建立和临床应用［J］．中国免疫学杂志，1999，15（2）：74－76．
［4］ 段佩若，张励力，韩洪彦，等．单克隆抗体用于免疫荧光技术快速检测副流感病毒抗原的研究［J］．中华微生物学和免疫学杂志，1992，8（4）：42－44．
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［7］ GLEZEN WP．Parainfluenza virus type 3：Seasonally risk of infection and seasonally reinfection children［J］．J Infect Dis，1984，15：851－855．
［8］ HEINEN E，HERBST W，SCHMEER N．Isolation of a cytopathogenic virus from a case of porcine reproductive and respiratory syndrome and its characterization as parainfluenza virus type 2［J］． Arch Virol，1998，143（11）：2 233－2 239．
［收稿日期］ 2000-05-16； ［修回日期］ 2000-07-03
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