卵巢肿瘤一氧化氮合酶的活性研究

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 临床研究

作者：武艺　王亚军　宋和存

单位：武艺（中国医科大学第一临床学院妇科，沈阳，110001）；王亚军（中国医科大学第一临床学院妇科，沈阳，110001）；宋和存（中国医科大学第一临床学院妇科，沈阳，110001）

　　关键词： 卵巢肿瘤；一氧化氮；一氧化氮合酶

　　【摘要】　目的　探讨一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)与卵巢肿瘤间的关系，并观察其在卵巢肿瘤组织中的分布。方法　NOS的比活性用分光光度法，NOS在组织中的分布用NADPH-黄递酶组化染色法。结果　(1)卵巢恶性肿瘤组织中NOS活性较正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织显著增高(P＜0.01)。(2)卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中NOS含量差异无显著性(P＞0.05)。(3)NOS活性随卵巢恶性肿瘤组织分化程度降低而增高(P＜0.01)。(4)恶性肿瘤患者血清中NOS活性高于正常对照。(5)在卵巢恶性肿瘤组织中NADPH-黄递酶染色呈阳性，而间质呈阴性；癌组织中染色深度高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤组织(P＜0.01)。(6)NOS主要分布于癌细胞的胞膜和胞浆，胞核基本不着色。结论　一氧化氮(nitric oxide, NO)合成的增多，可能与卵巢恶性肿瘤生长及恶性行为有关，卵巢恶性肿瘤组织中NOS含量增高是NO合成增多的重要原因之一。

The study of nitric oxide synthase in ovary tumor

WU Yi, WANG Yajun, SONG Hecun.

　　（Department of Gynecology, The first Clinical College, China Medical University, Shenyang 110001, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the activity of nitric oxide synthase (NOS) in ovarian tumors.Methods　Spectrophotometry was used to examine NOS activity and NADPH-diaphorase histochemistry to identify its localization.Results　The activity of NOS was significantly higher in malignant than in normal ovarian tissue and benign ovarian tumors (P＜0.01). There was negative correlation between NOS activity and tumor cell differentiation. NOS reaction product was mainly located in cancer cells, and was negative in the interstitial tissue. Furthermore, NOS was mostly located in membrane and cytoplasm of the cancer cell.Conclusion　Increase in nitric oxide synthase activity might be related to the growth and malignant behavior of ovarian cancer.

　　【Subject words】　Ovarian neoplasms; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

　　一氧化氮（nitric　oxide, NO）在人体多个系统的生理、病理过程中起着重要作用。随着有关研究的深入，NO与肿瘤生物学的关系越来越受到人们的关注。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）是催化NO生物合成的酶。不少研究表明，许多肿瘤细胞中存在NOS，如神经胶质细胞瘤、结肠腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺的鳞状细胞癌等^［1］。我们应用分光光度法和NADPH-黄递酶染色法对卵巢肿瘤组织及肿瘤患者血清中NOS活性进行检测，探讨NOS与卵巢肿瘤的关系。

　　材料与方法

　　一、临床资料

　　1.研究对象：标本选自1997年5月～1998年6月中国医科大学妇科住院手术患者。正常卵巢组织16例，选自黄体破裂或子宫肌瘤切除的一侧卵巢。年龄最小25岁，最大54岁，平均年龄39岁。卵巢良性肿瘤组织23例，其中浆液性囊腺瘤13例，粘液性囊腺瘤7例，畸胎瘤3例。年龄最小18岁，最大75岁，平均47岁。卵巢恶性肿瘤组织40例，其中浆液性囊腺癌28例，粘液性囊腺癌5例，卵巢子宫内膜样癌3例，无性细胞瘤1例，恶性畸胎瘤1例，颗粒细胞瘤2例。年龄最小20岁，最大68岁，平均年龄48岁。三组患者年龄进行统计分析，差异无显著性（P＞0.05）。

　　2.血清标本：选正常献血者20例，女性，年龄在30～50岁之间；恶性肿瘤住院手术患者，术前抽取血样。取静脉血2 ml，析出血清后，1 500转/min离心5 min，取上清放入深低温冰箱保存，成批一同检测。

　　3.组织标本：肿瘤或组织切下后，立即采取标本，放入-80℃深低温冰箱内保存，成批一同检测。

　　二、方法

　　1.药品：NOS试剂盒购自南京建成生物研究所，NADPH及硝基四氮唑蓝(NBT)均为Sigma产品。

　　2.检测：(1)组织及血清NOS活性用分光光度法，严格按NOS试剂盒说明进行。(2)测蛋白含量用酚试剂法。(3)NOS组织观察用NADPH-组化染色法。标本取约0.6 cm×0.6 cm×0.2 cm大小，OCT包埋，在恒温冰冻切片机中制成12 μm的冰冻切片，冷丙酮固定10 min放入孵育液中，37℃恒温箱中孵育50 min。孵育液含：NADPH 0.1 mg/ml，NBT 0.5 mg/ml，PBS(pH 7.47) 0.1 mol/L，漂洗3次，终止反应。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果观察：光镜下观察后用图像分析仪分析。阴性反应中：(1)孵育液中不加NADPH；(2)孵育液中不加NBT。以阴性对照为背景测透光度为灰度值。

　　3.统计分析：用SAS软件包进行方差分析和t检验。

　　结果

　　1.组织中NOS比活性比较：正常卵巢组织与卵巢良性肿瘤组织间的比较，NOS比活性差异无显著性(P＞0.05)，但二者均明显低于卵巢恶性肿瘤组织，差异有显著性(P＜0.01，表1 )。

表1　3 组组织中NOS比活性比较

组别	例数	NOS比活性（U/mg蛋白，±s）
正常组	16	0.8313±0.3036
良性组	23	0.9263±0.2351
恶性组	40	1.9069±0.8320

　　2.不同分化的卵巢上皮性癌组织中NOS的比活性：将36例卵巢上皮性癌根据不同分化程度将其分为3组，高分化组7例，中分化组10例，低分化组19例。结果表明，中、高分化组NOS活性差异不显著（P＞0.05)，但低分化组与中、高分化组比较，则明显升高（P＜0.01) 。NOS比活性随分化程度的降低而升高(表2)。

表2　不同分化程度的卵巢恶性肿瘤组织中NOS的比活性

组别	例数	NOS比活性（U/mg蛋白，±s）
高分化组	7	1.1528±0.2751
中分化组	10	1.6450±0.3599
低分化组	19	2.3514±0.8558

　　3.血清中NOS比活性：取20例正常妇女血清与卵巢恶性肿瘤患者血清相比较，卵巢恶性肿瘤患者血清中NOS比活性高于正常妇女血清中NOS比活性（P＜0.05，表3)。

　　4.组织冰冻切片NADPH组化染色结果：典型的NOS染色阳性细胞为胞浆胞膜着色呈深蓝色，胞核基本不着色。卵巢癌组平均灰度值为78.6641，卵巢良性肿瘤组为97.3997，正常卵巢组为99.1028。卵巢良性肿瘤组与正常卵巢组差异无显著性（P＞0.05) 。卵巢癌组与其他两组比较，则明显深染（P＜0.01，表4)。

表3　正常组与恶性组血清中NOS的比活性比较

组别	例数	NOS比活性（U/mg蛋白，±s）
正常组	20	0.2653±0.0566
恶性组	33	0.3648±0.1060

表4　3 组组织冰冻切片NADPH染色结果

组别	例数	均值（±s）
正常组	15	99.1028±7.2082
良性组	20	97.3997±6.5061
恶性组	36	78.6641±5.5020

　　讨论

　　NO在生物体内作为重要的信使分子和效应分子是在80年代后期才被发现和证实的。随着研究的深入，已成为当代生物医学研究的热点之一。NO在体内的半衰期仅为3～6 s，由于它不能被储存，因此它的生物合成主要受NOS的活性的调节。

　　目前已经确定的NOS的亚型3种，分别由不同的基因编码。大多数文献将其分为3种：神经元型NOS（neuronal NOS，nNOS）、内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）和诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）^［2］。

　　近年来的研究发现，在人类的多种肿瘤中，NOS活性和表达增高。在星型胶质细胞瘤中，两种类型的cNOS表达均增加，而iNOS发现较少^［2］。Thomsen等^［3］对11例卵巢肿瘤的研究表明，NOS位于肿瘤细胞中，活性是Ca²⁺依赖型（结构型，cNOS），而正常组织中未能检测到，且其活性与恶性程度呈正相关。另外，在人的脑肿瘤、乳腺癌、胃癌及结肠癌中NOS表达均增加^［1］。这些研究结果均与本研究结果一致。

　　NOS活性升高可使NO的合成增加，而高浓度的NO对肿瘤有什么意义呢？ Jenkins等^［4］将NOS基因导入人的肿瘤细胞株使其持续产生NO，并与未导入NOS的亲代野生型瘤株进行体内实验比较，发现其在裸鼠体内转染的肿瘤克隆持续快速生长，生长速度较对照组快，在肿瘤出现较多新生血管，且较对照组更有侵袭力。这些体内研究均证明，肿瘤细胞持续性释放NO可以促进肿瘤生长。我们的研究表明，卵巢癌细胞中的NOS活性较正常及良性肿瘤明显升高。这些是否可以提示NOS与卵巢癌的快速生长及早期转移有关。Wagatsuma等^［5］的研究结果表明，肿瘤的生长是血管依赖性的，血管为肿瘤提供营养和转移途径。在没有新血管形成之前，肿瘤只能生长到1～2 mm³且不会发生转移。在新血管形成以后，肿瘤会呈指数倍增长，转移的机会亦随之增高。Mongan等^［6］的研究表明，恶性卵巢上皮性肿瘤微血管密度明显高于良性肿瘤。

　　综上所述，卵巢恶性肿瘤中NOS活性增高导致高浓度的NO，通过促进新生血管来促进肿瘤的生长和转移。因此，NOS活性升高与卵巢肿瘤的恶性行为有关。

　　虽然Thomsen等^［3］的研究表明，肿瘤细胞中NOS在转录水平即有所增高，但NOS活性增高的机制尚未明了，而NOS与肿瘤之间的关系也尚未清楚，仍需进一步研究。

　　参考文献：

　　［1］　Sagar SM,Singh G,Hodson DI.Nitric oxide and anti-cancer therapy.Cancer Treat Rev,1995,21:159-181.

　　［2］　Forstermann U , Kleinert H. Nitric oxide synthase: expression and expressional control of the three isoforms. Pharmacol, 1995,352:351-364.

　　［3］　Thomsen LL,Lawton FG, Knowles RG.Nitric oxide synthase activity in human gynecological cancer.Cancer Res,1994,54: 1352-1354.

　　［4］　Jenkins DC,Charles IG,Thomsen LL.Roles of nitric oxide in tumor growth.Proc Natl Acad Sci USA,1995, 92: 4392-4396.

　　［5］　Wagatsuma S,Konno R,Soto S, et al. Tumor angiogenesis,hepatocyte growth factor and c-Met expression in endometrial carcinoma. Cancer, 1998,82:520-530.

　　［6］　Mongan G,Wilkinson N, Buckley C. Angiogenesis in normal,hyperplastic and neoplastic endometrium.J Pathol, 1996, 179:317-320.

收稿日期：1999-05-11