BRCA1基因在原发性卵巢癌组织中突变的研究
癌症 1999年第5期第18卷 基础研究
作者：邓文国 曾瑞萍 蒋玮莹 杜传书
单位：中山医科大学医学遗传学教研室（广州，510089）
关键词：原发性卵巢肿瘤；BRCA1基因；突变；PCR-SSCP；序列分析
【摘 要】 目的:探讨BRCA1基因突变在原发性卵巢癌发生中的作用。方法:应用聚合酶链反应-单链构像多态（PCR-SSCP）银染技术及PCR产物直接序列测定的方法检测了56例原发性卵巢癌BRCA1基因第2、5、11、21外显子区域上的突变情况。结果:11例存在PCR-SSCP电泳条带异常，经测序确证了BRCA1基因突变的性质。BRCA1基因突变率在初诊年龄和临床分期上无显著差异。结论:BRCA1基因突变与原发性卵巢癌的发生紧密相关。
中图分类号:R737.9；R730.231 文献标识码：A 文章编号：1000-467X（1999）05-0514-04
Mutation analysis of Breast cancer gene 1 (BRCA1) in primary ovarian cancers
DENG Wen-guo，ZENG Rui-ping，JIANG Wei-ying，et al.
Department of Medical Genetics, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,P.R. China
【Abstract】Objective: To analyze the role and types of breast cancer gene 1(BRCA1) mutation in primary ovarian carcino genesis.Methods: The mutation of BRCA1 including exon 2、5、11 and 21 were detected. PCR-single strand conformation polymorphism analysis(SSCP) and sequencing were performed on 56 cases of human primary ovarian cancer.Result: 11 cases were presented altered single strand band-shifts by PCR-SSCP. Cases showing abnormal band-shifts in SSCP were subsequently confirmed to be single-base change by sequencing. The relationship between BRCA1 mutations and ages at diagnosis and tumour'stages was investigated,no statistical difference was found.Conclusions: The mutations of BRCA1 gene are involved in carcinogenesis and development of primary ovarian cancer.
Key words:Primary ovarian cancer; BRCA1 gene; Mutation; PCR SSCP; Sequencing
BRCA1基因是在乳腺癌发生的生化基础未知的情况下，首先由美国Utah州大学Skolnick小组[1]采用定位克隆方法分离出来的乳腺卵巢癌易感基因。迄今为止，其基因产物的功能、生物学作用尚不清楚。通过对基因侧翼的信息丰富的多态标记位点进行杂合性缺失(LOH)分析，发现在75％的原发性卵巢癌中存在包括BRCA1在内的17q缺失，提示BRCA1基因在卵巢癌中起着一定的作用[2]。本文对BRCA1基因在原发性卵巢癌组织中的突变情况进行研究，旨在阐明BRCA1基因突变的特点及其在原发性卵巢癌演进过程中的意义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
经病理确诊的56例原发性卵巢癌及其癌旁正常组织取自中山医科大学附属第一医院妇科和附属肿瘤医院妇瘤科（癌标本编号为V1～56）。手术切除组织迅速置液氮中冷冻，然后放入-70℃冰箱中保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 组织DNA的提取:将组织剪碎，放在匀浆器中研成匀浆，按常规酚氯仿抽提法[3]提取DNA，DNA沉淀溶于TE液中，DNA的纯度和浓度经紫外分光光度计测定计算。
1.2.2 PCR扩增:本实验所用8对引物根据Sknolnick研究资料合成[4]，引物序列见表1。PCR反应体系为25μl，内含样品DNA0.1μg，10×PCR缓冲液2.5μl，4种dNTP各200μmol,每端引物20pmol,TaqDNA酶1.0U。用无菌矿物油覆盖，在PE480热循环仪中97℃5分钟后进行循环:94℃30秒，55℃45秒，72℃60秒，35个循环后于72℃延伸5分钟。取PCR产物5ul经琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余放入-20℃冰箱保存。
表1 BRCA1基因部分引物序列
|
外显
子 |
位置 |
引物序列(5→3’) |
片段大小
(bp) |
复性温度
(℃) |
|
2 |
101-199 |
GAAGTTGTCATTTTATAAACCTTT |
250 |
60 |
| |
|
TGTCTTTTCTTCCCTAGTATGT |
|
|
|
5 |
254-331 |
CTCTTAAGGGCAGTTGTGAG |
200 |
60 |
| |
|
TTCCTACTGTGGTTGCTTCC |
|
|
|
11G |
2142-2460 |
GCAACTGGAGCCAAGAAGAGTAAC |
319 |
55 |
| |
|
CCTGAGTGCCATAATCAGTACCAGG |
|
|
|
11H2 |
2335-2620 |
AAGTGTCTAATAATGCTGAAGACCC |
286 |
55 |
| |
|
CCCAATGGATACTTAAAGCCTTCTG |
|
|
|
1H2 |
2598-2930 |
GAAGGCTTTAAGTATCCATTGGG |
333 |
55 |
| |
|
CTTATCTTTCTGACCAACCACAGG |
|
|
|
11L |
3138-3804 |
TCAATGTCACTTGAAAGAGAAATGG |
300 |
55 |
| |
|
CAGGATGCTTACAATTACTTCCAG |
|
|
|
11N |
3552-3804 |
GTTTGTTCTGAGACACCTGATGACC |
253 |
55 |
| |
|
AGTGTTGGAAGCAGGGAAGCTC |
|
|
|
21 |
5397-5451 |
AAGCTCTTCCTTTTTGAAAGTC |
275 |
60 |
| |
|
GTAGAGAAATAGAATAGCCTCT |
|
|
（注：G、H2、I2、L、N为外显子11内的不同区域）1.2.3 SSCP和银染:取8μlPCR产物与等量上样缓冲液（95％去离子甲酰胺，20mMEDTA,0.05％溴酚蓝，0.05％二甲基苯青蓝FF）混合，煮沸10分钟，冰上骤冷5分钟，然后上样于8％聚丙烯酰胺凝胶（49∶1），在1×TBE缓冲液体系中电泳，100V14小时。电泳结束后，凝胶按略加改进的Brandt[5]方法进行银染:10％乙醇固定5分钟，1％HNO3浸泡3分钟，然后用0.012mol/LAgNO3染色20分钟，清水飘洗数次，再用0.28mol/LNa2CO3加0.4％甲醛混合液显影至条带清晰，最后用10％冰醋酸终止显色反应，制备干胶并拍照。
1.2.4 序列分析:采用双脱氧链终止法测序。将PCR扩增产物经BioRad纯化试剂盒纯化，以PCR扩增引物作为测序引物，（α-32P）dATP(北京亚辉生物公司)末端标记引物按测序酶（Version2）测序法[6]进行测序。测序产物经7mol/L尿素/6％PAG/1×TBE,50℃,1200～1800V电泳至溴酚蓝接近凝胶下缘。取胶，放射自显影，读序。
1.2.5 统计学分析:采用列联表的卡方（χ2）检验分析。
2 结果
2.1 PCR-SSCP分析结果
56例肿瘤组织及癌旁组织均能扩增出特异性片断。PCR产物SSCP分析，发现11例显示有SSCP电泳迁移率的改变，其中V53显示为第5外显子的电泳异常;V45、V47显示为第21外显子的电泳异常;V1、V2、V3、V10、V17、V29、V55、V63均显示为第11外显子的电泳条带异常(见图1)。
图1 BRCA1基因外显子11H2的SSCP结果:
1→正常卵巢组织,6→V1、7→V55泳动异常
2.2 序列分析结果
在SSCP分析异常的标本中，7例BRCA1基因第11外显子的标本经测序证实了突变。两例(V1和V55)均为nt3232A→G突变，导致第1034位密码子GAA→GGA，使所编码的氨基酸由原来酸性的谷氨酸变成了中性的甘氨酸（见图2）。一例(V2)为nt2731G→A突变，导致第871位密码子CCG→CUG，使所编码的氨基酸由脯氨酸变成了亮氨酸。一例(V17)为nt2202G→C突变，导致第695位密码子由GAU→CAU，使所编码的氨基酸由酸性的天冬氨酸变成了碱性的组氨酸。一例(V63)为nt2450处插入一个碱基C，造成移码突变，使所编码的氨基酸肽链终止于密码子789位。一例(V10)及癌旁组织均为nt2430T→C突变，导致第771位密码子UUG→CUG，形成同义突变。另一例(V29)也为同义突变，nt2471G→T突变，使第786位密码子CUG→CUU。（见表2、图3）
表27 例序列分析证实的BRCA1点突变特征
|
标本 |
核 酸位置和突性质 |
密码子 |
氨基酸改变 |
|
V1 |
3232A→G |
第1034位(GAA→GGA) |
Glu→Gly |
|
V55 |
3232A→G |
第1034位(GAA→GGA) |
Glu→Gly |
|
V17 |
2202G→C |
第695位(GAU→CAU) |
Asp→His |
|
V2 |
2731G→A |
第871位(CCG→CUG) |
Pro→Leu |
|
V63 |
2450插入C |
第778位(GGC→CGG) |
移码突变 |
|
V10 |
2430T→C |
第771位(UUG→CUG) |
Leu→Leu |
|
V29 |
2471G→T |
第786位(CUG→CUU) |
Leu→Leu |
glu:谷氨酸 Gly:甘氨酸 Asp:天冬氨酸 His:组氨酸
Pro:脯氨酸 Leu:亮氨酸 Arg:精氨酸
2.3 BRCA1基因突变与临床特征的关系
分析了56例原发性卵巢癌BRCA1突变率与初诊年龄和临床分期的关系，结果显示:初诊＜50岁者中检出BRCA1基因突变4例,未检出14例;初诊≥50岁者中检出BRCA1基因突变7例,未检出31例。经统计学处理,BRCA1基因突变与初诊年龄无统计学上的差异（P＞0.05）。检出突变组的平均初诊年龄52.5岁，未检出组为53岁。
图2 序列分析:V1、V55BRCA1基因nt3232A→G突变
导致第1034位密码子编码的Glu(谷)→Gly(甘)
图3 序列分析:V29BRCA1基因nt2477G→T突变
与临床分期关系,结果显示:临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期检出BRCA1突变者分别为2例、1例、4例、4例;未检出突变者分别为8例、9例、14例、10例,以及4例分期不详者,经统计学处理,与临床分期也无统计学差异（P＞0.05）。
3 讨论
BRCA1基因定位于17q21，全基因DNA约100Kb，包含22个可编码外显子，编码1863个氨基酸。DNA可转录7.8KbmRNA[7]。国外文献报道，约87％的乳腺卵巢癌家族发现有该基因的变异。BRCA1基因突变主要有三种类型:1)移码突变:其结果引起密码子易位扰乱基因信息，产生无意义蛋白;2)错义突变:即突变发生在编码基因，改变了进化上高度保守的氨基酸;3)无义突变:产生终止密码子，使氨基酸肽链截短。这些突变都将导致蛋白质合成质或量的改变，影响蛋白功能，促进肿瘤的发生[8,9]。
在本研究中发现了4例错义突变，1例移码突变，2例同义突变。它们均位于第11外显子编码区。2例标本(V1、V55)nt3232A→G错义突变，导致第1038位密码子编码的氨基酸由酸性的谷氨酸改变为中性的甘氨酸，V17nt2202G→C突变导致所编码的氨基酸由原来亲水酸性的天冬氨酸改变为亲水碱性的组氨酸，这两种突变均造成其电荷性质发生了一定的变化，可能会引起蛋白质构象改变而影响BRCA1正常的生物学功能。V63nt2450插入C突变为移码突变，将导致蛋白质合成在密码子789位终止，产生截短了的无意义蛋白，BRCA1的正常调控作用将丧失。V2nt2731G→A转换和V17nt2202G→C颠换均出现在高度保守的编码区，国外文献未见报道，可能为一新发现的突变位点。nt2731突变使原来的脯氨酸改变为亮氨酸，虽然这两个氨基酸均为中性，但脯氨酸结构特殊，N原子在刚性的五元环中，它所形成的肽键N原子上没有H，所以不可能形成氢键。而亮氨酸的结构不同，肽键的NH和相隔3位原子的CO可以形成氢键，使多肽链卷曲成α-螺旋。因此这些突变均可能是病理性突变，在卵巢癌的发生过程中起着一定的作用。
为了探讨BRCA1基因突变与临床的关系，我们比较了检出突变病例组与未检出突变病例组的初诊年龄、临床分期的差异，结果显示突变组病例平均初诊年龄为52.5岁，并且大多数是Ⅲ期和Ⅳ期病例，但与对照组比较无统计学意义的显著性差异。Stephen[10]等研究了53例卵巢癌BRCA1突变病例的临床特征，发现突变病例的平均发病年龄为48岁，比对照组提早了13年，并且这些病例均有阳性家族史。临床分期的结果与我们的分析基本一致。在初诊年龄比较方面存在差异，原因可能是如下:Stephen等研究的是家族性卵巢癌，BRCA1突变为干细胞系突变，多为早发；而我们研究的是随机卵巢癌病例，无明显阳性家族史，存在体细胞突变的可能，因而发病较晚。
〔参考文献〕
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收稿日期：1998-12-25;修回日期:1999-05-95
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