钙拮抗剂增加化疗中卵巢癌细胞凋亡相关因子的研究
癌症 1999年第3期第18卷 基础研究
作者：尹格平 陈诵芬 孙晓明Δ 吴战英 朱彤宇
单位：济南军区总医院妇产科(济南，250031)；△流式细胞研究室
关键词：卵巢肿瘤；钙拮抗剂；凋亡；化学疗法
【摘要】目的：探讨钙拮抗剂(CA)对促进化疗药物诱发卵巢癌细胞凋亡的作用。方法：从68例首次手术及17例复发卵巢癌患者腹水中提取富含癌细胞的悬液，应用3种荧光单克隆抗体P170、CD95、及Apo2.7标记，经流式细胞仪检测。结果：应用CA组化疗后癌细胞CD95及Apo2.7含量均高于对照组(P＜0.05)；对癌细胞P170含量无明显影响(P＞0.05)；复发组癌细胞P170含量显著高于初发手术组(P＜0.05)，化疗可使外周血淋巴细胞CD95及Apo2.7含量增加。结论：CA对加强化疗药物疗效有明显的作用，具有重要的临床价值。
中图号：R737.31；R730.53 文献标识码：A 文章编号：1000467X(1999)03－0273－03
The study of ovarian carcinoma cell apoptosis in chemotherapy
combined with calcium antagonist
YIN Ge－ping, cHEN Song－fen,SUN xiao－ming,et al,Jinan Military General Hospital, Jinan 250031,China
【Abstract】Objective：To explore the role of calcium antagonist(CA)in the improvement of ovarian carcin－oma－cell－apoptosis induced by chemotherapy.Methods：The samples of ascites cancer cells(ACC) were colleccted in sixty－eight primary and seventeen recurrent ovarian carcinomas, immunologically marked by three kinds of fluorescent monoclonal antibodies－P170(p－gp),CD95(Fas/Apo－1) and Apo2.7, and then determined by flow cytometry.Results：(1) the CD95 and Apo2.7 contents of ACC were statistically more in CA group than in non－CA group(P＜0.05)；(2) the CA could not affect the P170 contents of ACC; (3) The P170 contents were statistically increased in recurent group(P ＜ 0.05); (4) The CD95 and Apo 2.7 contents of peripheral lymphocyte were also increased in chemotherapy combined with CA.Conclusions：The calcium antagonist can obviously increased the apoptotic rate of ACC in ovarian carcinoma induced by chemotherapy and has important clinical significance.
Key words：Ovary neoplasma;Apoptosis;Antagonist calcium; Chemotherapy
近年来以顺铂为主的联合化疗已使卵巢癌患者的生存时间明显延长，但5年生存率却改变不大，其主要原因就是随着化疗时间的延长，癌细胞对多种药物产生耐药性〔1，2〕。而钙拮抗剂(Calciumantagonist.CA)中的部分为耐药调变剂(Drugresistancemodifier.DRM.),可部分逆转这种耐药性，增加癌细胞对化疗药物的敏感性〔3〕。本研究通过对化疗前后外周血淋巴细胞(PBL)及卵巢癌腹水癌细胞多药耐药基因(Multidrugresistantgene.MDR)表达产物P糖蛋白(P170、P－gp)和凋亡因子Fas抗原(CD95)及线粒体膜蛋白Apo2.7〔4〕的定量对比研究，并结合临床表现，探讨几种CA对化疗药物诱导上述几种细胞凋亡因子增加的作用以及对PBL的影响。
1 材料及方法
1.1 临术资料
1.1.1 病例：68例初发卵巢癌为我院1995年12月至1998年2月住院患者，有完整的临床病理资料，应用CA者38例(称CA组)、未用CA者30例(Non－CA组)。手术前先行腹腔穿刺抽取腹水50ml(细胞学检查均见多数癌细胞)，并行顺铂(DDP)腹腔灌注，同时抽外周静脉血2ml(抗凝)，3～5天后在行减灭术时又抽腹水及外周静脉血标本。本组术后复发并出现腹水者17例，再予腹腔化疗前及化疗后3～5天抽腹水50ml，化疗中应用CA者11例，未用CA者6例，并观察1个月后腹水增长量。
1.1.2 化疗药物及CA的应用：主要是顺铂(DDP100mg/M2体表面积)单独腹腔灌注，每疗程1次，或加用环磷酰胺静脉滴注(5mg/kg体重)每日1次，共5天和/或阿霉素(1mg/kg体重)静滴1次。CA主要选用硝苯啶(心痛定、NDP)和异搏定(VPL)。血压高者选用DNP10～20mg，每日3次口服；脉快者首选VPL20～40mg口服，每日3次；患者血压脉搏正常时首选NDP。自化疗前3日至化疗后4日应用，用药期间注意血压、脉搏及心电图变化。
1.2 研究方法
1.2.1 特殊试剂：异硫氢酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体CD95和P170，R－藻红蛋白(PE)标记的Apo2.7以及用于排除免疫标记误差的羊抗鼠IgG1(作为免疫标记阴性对照)，均由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产。
1.2.2 外周血淋巴细胞(PBL)的提取：将2ml抗凝静脉血加入淋巴细胞分离液2ml，离心(1500rpm×5min)，提取其中淋巴细胞层，再以磷酸缓冲液(PBS)2ml漂洗，同速离心2次，弃上清液备用〔5〕。
1.2.3 由腹水提取富含卵巢癌细胞的悬液(ACC)：无菌抽腹水50ml，肝素抗凝，离心(1500rpm×10min)，弃去上清后加入淋巴细胞分离液2ml，同速离心，收取分离液表面细胞，以2mlPBS漂洗离心1次，弃上清后将细胞加于100％∶65％的双层淋巴细胞分离液表面、离心(2500rpm×20min)，吸取65％分离液上界面的细胞即为ACC〔5〕。取少量细胞涂片，瑞氏染色后光镜下见异型细胞丰富，杂质细胞少。
1.2.4 单克隆抗体CD95、P170及Apo2.7免疫标记：取4支试管，各加样品500μl，分别加入CD95、P170、Apo2.7及IgG1工作液20μl，避光室温下20min。离心(2000rpm×10min)，除上清液后加PBS1ml，同速离心1次，弃上清后再加PBS500μl待检。
1.2.5 流式细胞仪检测：FACScan型流式仪(美国BD公司产)，上机收集1万个细胞，在Macintosh650型计算机上用CellQuestPlot软件(BD公司生产)分析数据，打印结果。统计方法用t检验。
1.2.6 P170、CD95、Apo2.7含量均以阳性细胞百分率表示〔6〕。
2 结果
2.1 化疗前后患者PBL凋亡因子的改变(表1)
表1 腹腔化疗前后PBL凋亡因子比较(
±s)
| 组别 |
例数 |
CD95含量(％) |
Apo2.7含量(％) |
| 化疗前 |
化疗后 |
化疗前 |
化疗后 |
| CA组 |
38 |
0.36±0.30 |
0.96±0.54△ |
0.22±014 |
0.39±021 |
| Non－CA组 |
30 |
0.34±0.28 |
0.78±049 |
0.24±017 |
0.36±0.29 |
注：△P＜0.05(与化疗前同种凋亡因子比较) 化疗后两组外周血淋巴细胞CD95含量均较化疗前显著性增加(P＜0.05)，而Apo2.7含量均值虽见增高，但无显著性差异(P＞0.05)。CA组化疗后CD95及Apo2.7含量均值均高于Non－CA组，但无统计学差异(P＞0.05)。
2.2 两组腹腔化疗前后腹水ACC之P170及凋亡因子含量变化(见表2)。
两组化疗前后P170含量差异无统计学显著性(P＞0.05)；CA组化疗后CD95及Apo2.7含量较化疗前显著性增加(P＜0.01)，均值分别增高4.11和6.70倍；Non－CA组化疗后CD95及Apo2.7亦较化疗前显著性增加(P＜0.05)，均值分别增加1.89和3.08倍。化疗前两组CD95及Apo2.7含量无显著性差异；化疗后CA组CD95及 apo2.7较Non－CA组均显著性增高(P＜0.05)，均值分别增加1.99和2.57倍。
2.3 复发组腹腔化疗前后ACC之P170及凋亡因子含量(见表3)。
表2 两组化疗前后ACC之P170及凋亡因子含量
| 组别 |
例数 |
P170含量(％) |
CD95含量(％) |
Apo2.7含量(％) |
| 化疗前 |
化疗后 |
化疗前 |
化疗后 |
化疗前 |
化疗后 |
| CA组 |
38 |
3.66±2.16 |
3.73±2.10 |
2.12±0.76 |
8.71±3.24△△ |
1.44±0.56 |
9.65±3.11△△ |
| Non－CA组 |
30 |
3.32±2.48 |
3.37±2.60 |
2.31±0.77 |
4.36±2.17△ |
1.22±0.71 |
3.76±1.32△ |
注：△P＜0.05，△△P＜0.01(均与化疗前同种因子比较)
表3 复发组化疗前后ACC之P170及凋亡因子含量(±s)
| 组别 |
例数 |
P170含量(％) |
CD95含量(％) |
Apo2.7含量(％) |
| 化疗前 |
化疗后 |
化疗前 |
化疗后 |
化疗前 |
化疗后 |
| CA组 |
11 |
5.76±3.14 |
5.94±3.26 |
1.76±0.55 |
7.36±3.16△△ |
1.12±0.46 |
6.12±2.32△△ |
| Non－CA组 |
6 |
6.37±3.19 |
6.57±3.26 |
1.81±0.51 |
3.11±2.17△ |
0.96±0.44 |
1.82±1.77 |
注：△P＜0.05，△△P＜0.01(均与化疗前同种因子比较) 复发组17例ACC之P170含量较初发组68例明显增加，有统计学意义(P＜0.05)，化疗前CD95及Apo2.7含量均值也较低，但无显著性差异0.05)。复发组中CA及Non－CA组化疗前后P170含量也无统计学差异(P＞0.05)，CA组化疗后CD95及Apo2.7含量增加非常显著(P＜0.01)；Non－CA组CD95含量显著性增加(P＜0.05)，而Apo2.7无显著性增加(P＞0.05)；化疗后CA组CD95及Apo2.7含量均较Non－CA组显著性增加(P＜0.01)。
2.4 腹腔化疗1个月后对腹水抑制的疗效
17例复发患者经腹腔化疗1个月后再行腹腔穿刺抽腹水，CA组11例最少者450ml，最多者3200ml，平均950±560ml，患者自觉腹胀较治疗前明显减轻者9例(占81.8％)；Non－CA组6例抽腹水最少者740ml，最多者3700ml，平均1250±660ml，患者自觉腹胀较治疗前减轻者3例(占50.0％)，t检验证实CA组1个月后腹水增长量显著低于Non－CA组(P＜0.05)。
3 讨论
细胞凋亡(Apoptosis)是细胞程序性死亡，与肿瘤细胞的生长、发展密切相关，是研究抗癌药物对肿瘤治疗敏感性非常重要的一项指示〔7〕。多药抗药性的癌细胞可以过度表达位于细胞表面的P170糖蛋白，后者属钙通道性质，它在钙离子参与下能加快化疗药物从细胞内的外排，是癌细胞自身保护的重要机制[8]。细胞表面分子CD95(又称Fas因子和Apo－1)属肿瘤坏死因子家族。Apo2.7抗原位于细胞线粒体膜上，两种抗原均可以反映细胞凋亡〔4，9〕。有实验证实，多种抗癌药物使癌细胞消退是通过细胞凋亡机制〔10，11〕，如顺铂及阿霉素等。故应用抗癌药物等有效手段诱导并促进癌细胞凋亡是肿瘤治疗十分有价值的课题。目前的研究认为卵巢癌5年生存率改观不大的主要障碍是例行的化疗过程中癌细胞逐渐产生了多药抗药性，故研究能够促进化疗疗效的手段意义重大。以往此类报告多见对癌细胞株的实验研究〔2，3，10，11〕。本文从卵巢癌腹水中提取出癌细胞探讨在CA参与下的化疗对癌细胞凋亡程度的影响，有更直接的临床意义。CA主要通过阻滞钙通道，使P170功能减退或失活，从而提高癌细胞内抗癌药物浓度，减弱了癌细胞对化疗药物的抵抗性，增加了化疗敏感性。
从本文结果看，应用CA并未减少ACC之P170含量，但可显著加强化疗药物对癌细胞的凋亡作用，这可能是使P170的功能不能发挥。复发组ACC之P170含量比初发手术时明显增加(P＜0.05)，提示复发组在数疗程化疗后，癌细胞多药抗药性的增加。此组未用CA化疗者，仅见CD95含量增高(P＜0.05)，而应用CA化疗者，则见CD95及Apo2.7含量均明显增加，有显著性意义(P＜0.01)。另外，从对复发组腹腔化疗的近期疗效看，CA组对腹水增长的抑制程度也好于Non－CA组(P＜0.05)。提示在复发患者腹腔化疗同时应用CA的作用更大。腹腔化疗中，应用CA组外周血淋巴细胞CD95含量较未应用组增加，虽无显著性差异，但提示在应用CA过程中，应注意保护机体免疫功能。 本文所选用的几种CA安全、经济、应用方便，可根据患者年龄、心率、血压及心电图等情况选择其一。
基金项目：1996年济南军区重点课题
参考文献
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收稿日期：1998－07－03；修回日期：1998－11－06
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