白血病多药耐药基因表达检测及其意义

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第11期

夏薇　朱广荣　温宏升　吴雨洁　许家仁　陆化　吴汉新　盛瑞兰

　　摘　要 目的：研究多药耐药基因在白血病中表达的情况及意义。方法：应用逆转录—多聚酶链反应（RT－PCR）和免疫细胞化学APAAP方法检测了50例白血病患者多药耐药（mdr－1）基因及P－糖蛋白（Pgp）的表达情况并进行分析研究。结果：mdr－1及Pgp的表达与患者的年龄有关，50岁以上患者的阳性率显著增高（P＜0.05,P＜0.01）。未经治疗的初诊患者mdr－1的阳性率显著低于反复化疗的患者（P＜0.05）。Pgp表达与临床疗效的总符合率为72.5％，低于mdr－1的表达与临床疗效的总符合率86％。两项指标联合检测，其临床疗效总符合率最佳91.3％。结论：mdr－1及Pgp是两个良好的临床多药耐药监测指标，尤以二者联合应用为佳。

　　关键词：白血病　多药耐药基因　化疗

　　多药耐药（multidrugresistance,MDR）导致的化疗失败是肿瘤治疗中亟待解决的问题。产生MDR的原因是多因素的，但mdr－1基因编码的P－糖蛋白（Pgp）的过度表达是一个重要机制。Pgp是一能量依赖性外排泵，通过影响细胞内的药物聚积使肿瘤细胞对各种疏水性细胞毒药物产生耐药。针对这一问题，我们分别采用不同的方法在不同的环节检测了多药耐药基因在RNA及蛋白水平的表达情况，以了解其临床意义及探讨两个指标的特点及关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例选择

　　50例临床患者均经临床、细胞形态学、免疫学，部分经分子生物学确诊，符合全国统一标准。其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）12例；急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）31例；慢性粒细胞性白血病（CML）1例；慢性粒细胞白血病急性变（CML－BC）4例；慢性淋巴细胞性白血病（CLL）1例及淋巴瘤（lym）（Ⅳ期）1例。按检测时患者的临床状况分为初诊组：即初诊未接受任何治疗的患者30例；复诊组：已确诊并接受多次化疗的患者20例。全组两个以上疗程化疗不缓解（NR）或早期（6个月以内）复发的患者24例为难治组；18例达CR为完全缓解组。年龄15～80岁，中位年龄47.5岁。50例患者中男性23例，女性27例。确诊后ALL患者常规接受DOP、DOAP、DOLP等方案治疗；ANLL患者接受DA、HA、MA及EA等方案治疗；淋巴瘤选CHOP等方案治疗，并观察疗效。

　　1.2　细胞株

　　分别以K₅₆₂人慢性粒细胞白血病急性变敏感细胞株及K₅₆₂/VCR长春新碱诱导的多药耐药细胞株（均由南京铁道医学院附属医院血液科赠送）作为试验的阴性及阳性对照。

　　1.3　试剂

　　mdr－1及β₂微球蛋白（β₂MG）（作为内对照），引物设计参见文献[1]，两对引物序列如下：mdr－1正义引物：5′CCCATCATTGCAATAGCAGG3′mdr－1反义引物：5′GTTCAAACTTCTGCTCCTCA3′β₂MG正义引物：5′ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′β₂MG反义引物：5′ATCTTCAAACCTCCATGATG3′上述引物均由美国Cybersyn公司合成，其中mdr－1引物扩增片段长度为157bp；β₂MG引物扩增片段长度为114bp。M－MLV逆转录酶为美国GIBCO公司产品；随机引物，RNasin，Taq酶及dNTP等均购自美国promega公司。

　　抗Pgp单克隆抗体：PHMAO₂购自中国医学科学院血液学研究所。APAAP试剂盒是北京邦定生物医学公司产品。

　　1.4　方法

　　1.4.1　mdr－1基因RNA水平检测采用RT－PCR方法。根据刘炳仁等建立的方法^[2]，结合本室条件略加改动。用异硫氰酸胍（AGPC）法提取细胞总RNA。取1μgRNA加随机引物，4×dNTP，m－MLV逆转录酶及RNasin等37℃1小时，逆转录cDNA。PCR：取cDNA4μl，加上两对引物，4×dNTP，Taq酶及MgCl₂等，于94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分10秒，30个循环周期。取扩增产物10μl，在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，再以1μg/ml溴乙锭染色，紫外灯下观察照相。色谱扫描仪扫描，计算mdr－1与β2MG的比值。

　　1.4.2　Pgp检测采用APAAP免疫细胞化学法。用PBS调整细胞浓度在(1～3)×10⁶/ml范围，涂片、固定。10％马血清封闭内源性抗体（湿盒内进行，以下同）20分钟。加PHMAO₂单抗1小时，PBS清洗。后分别加二抗、三抗作用各30分钟，加底物液37℃20分钟显色，苏木素复染，最后显微镜下观察结果。计数200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率。

　　1.5　统计学处理

　　t检验或χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　多药耐药基因表达的标准及特点

　　mdr－1与β₂MG比值大于33％者为mdr－1基因阳性；经正常马血清代替单克隆抗体作阳性对照，以阳性细胞数大于2％为Pgp阳性。K₅₆₂敏感细胞的mdr－1及Pgp均为阴性；K₅₆₂/VCR耐药细胞的mdr－1与β₂MG的比值大于100％，Pgp阳性细胞数大于98％。50例患者mdr－1基因阳性率为48％（24/50），其中40例患者同时进行Pgp的检测，阳性率为35％（14/40）。

　　2.2　多药耐药基因表达与临床特征的关系

　　经统计，mdr－1基因及Pgp的表达与患者的性别、血象、骨髓中幼稚细胞数的高低及肝脾肿大等因素均无关（P＞0.05），但与患者的年龄有关，详见表1。

表1　患者年龄与多药耐药基因表达的关系

　　不同类型白血病mdr－1基因及Pgp的表达有所不同，经统计两种检测方法在ALL及ANLL中的阳性率无显著性差异（P＞0.05）。在ANLL各亚型中从M₁到M₆均有不同程度表达，以M₄，M₅及M₆表达偏高，M₃型表达偏低，但因例数的关系，在统计学上亦无显著性差异存在（P＞0.05），详见表2。

表2　ANLL各亚型中多药耐药基因表达情况

　　2.3　多药耐药基因表达与临床疗效间的关系

　　不同组别患者的mdr－1及Pgp表达情况见表3。

表3　不同组别患者多药耐药基因表达情况

　　经计算Pgp表达与临床疗效的阳性符合率为78.57％，阴性符合率69.23％，总符合率72.50％；mdr－1基因表达与临床疗效的阳性符合率为87.50％，阴性符合率为84.62％，总符合率为86.00％；而mdr－1及Pgp表达相同的阳性符合率是100％，阴性符合率为86.67％，总符合率为91.30％。二种检测方法与临床疗效间的关系详见附图。

*　总缓解率：完全缓解(CR)＋部分缓解(PR)

　　附图　多药耐药基因表达与临床疗效的关系

　　2.4　多药耐药基因表达与细胞表面抗原的关系

　　在29例ANLL患者中，mdr－1及Pgp均阳性者中有3例CD₃₄抗原阳性表达（分别为：76.00％，90.00％及31.00％），前2例为ANLL－M₄型患者，均为临床原发耐药，1～2个疗程化疗无效，均短期内死亡。后1例为M₅患者，经DA、HA、ME及EA等多种方案治疗，最终在确诊2年后复发难治死亡，而ALL患者的mdr－1及Pgp表达与细胞表面抗原之间未发现明显的相关性。

　　3　讨论

　　随着对MDR研究的不断深入，其临床检测变得越来越重要。目前检测mdr－1基因表达的手段一是RNA水平的检测，即用Northern杂交或逆转录—多聚酶链式反应（RT－PCR）等技术检测mdr－1的mRNA水平表达；一是蛋白质水平的检测，即采用各种组织或细胞化学法，借助单克隆抗体对Pgp表达进行检测。我们正是分别采用了RT－PCR法及免疫细胞化学法检测了mdr－1基因在RNA及蛋白水平的表达。

　　我们的结果显示这两个指标与临床关系密切。难治组患者的mdr－1及Pgp阳性表达率明显高于完全缓解组的患者；反复治疗的患者其mdr－1的阳性率也显著高于初诊未经治疗的患者。初诊组30例患者中有11例mdr－1阳性，经随访其中7例患者化疗未缓解，即有23.3％（7/30）的患者存在原发（intrinsic）耐药，此结果与有关报道相符^[3,4]。此外已接受化疗的复诊组患者的mdr－1阳性率显著高于初诊未治组患者，20例复诊患者中有14例未缓解，这一现象提示白血病患者反复多次接受化疗可诱导MDR的产生^[5]。我们的结果还显示7例50岁以上的患者mdr－1及Pgp的阳性率均明显增高，且这7例患者临床上均未缓解，预后不佳。这符合老年白血病难治的现象，提示其难治的原因之一是老年患者易合并MDR。

　　我们研究的另一个目的是了解mdr－1及Pgp这两个参数间的关系及意义。我们发现Pgp的临床符合率不如mdr－1的临床符合率。免疫细胞化学法简便、价廉，但结果判断有一定主观性，假阴性偏高，从表3中可看出初诊组与复诊组间RT－PCR法结果有显著性差异，而免疫细胞化学法两组间则无明显差异存在。另一方面Pgp的表达较RNA水平晚，即有一“滞后”现象。我们曾动态观察了1例ANLL－M₂患者，治疗前仅RT－PCR法阳性，细胞化学法阴性，经一段时间治疗（方案DA×2），患者未缓解，间隔4个月，再测Pgp结果阳性。而RT－PCR法敏感特异，但操作复杂、价格昂贵，存在少量假阳性。如表3显示2例完全缓解的患者mdr－1阳性。分析两种方法存在一定假阳性及假阴性的原因，排除操作不当因素，分析前者可能由于mdr－1/Pgp在一些正常组织如：肾上腺皮质、肝胆管上皮细胞、脑及睾丸等中有分布所致^[6]；后者则可能是非mdr－1/Pgp介导的MDR，如bcl－2及突变型p53基因上调，GST及Topo酶Ⅱ的表达及功能异常所致^[7]。两种方法联合应用明显降低了误差，虽然也存在少量假阴性，则更说明肿瘤耐药机制的复杂性。关于mdr－1基因阳性合并CD₃₄细胞抗原阳性的现象已有报道，Chin等认为mdr－1基因的表达受祖干细胞分化水平的影响，最原始的造血细胞Pgp表达最高^[8]。因此mdr－1/Pgp阳性者再合并CD₃₄细胞抗原阳性，预后凶险。

　　*　本文课题受国家自然科学基金青年基金资助(编号39400058)

　　作者单位：夏薇　朱广荣　温宏升　吴雨洁　许家仁　陆化　吴汉新　盛瑞兰　南京医科大学第一附属医院血液科　南京市210029

　　参考文献

　　1　Noonan KE,Beck C,Holzmayer TA,et al. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990;87:7160

　　2　刘炳仁，熊冬生，杨纯正，等．逆转录聚合酶链反应法检测肿瘤细胞耐药基因的表达．中国癌症杂志，1993;3(1):38～40

　　3　Zhou DC,Marie JP,Suberville AM,et al. Relevance of mdr－ 1 gene expression in acute myeloid leukemia and comparison of different diagnostic methods.Leukemia,1992;6:879

　　4　Te Boekhorst PAW,Wittebol S,Hagemeijer A,et al. Predominance of the multidrug resistance phenotype in acute myeloid leukemia cells is associated with an immature (CD34) phenotype.Blood,1993;82:3157

　　5　Hu XF,Slater A,Wall DM,et al.Rapid up－ regulation of mdr－ 1 expression by anthracyclines in a classic multidrug－ resistant cell line. Br J Cancer,1995;71(5):931

　　6　Takashi Tsuruo.Mechanisms of multidrug resistance and implications for therapy. Jpn J Cancer Res(Gann),1988;79:285

　　7　温宏升．细胞凋亡与白血病耐药．国外医学输血分册，1997;5:296～9

　　8　Chin KV,Pastan I,Gottesman MM.Function and regulation of the human multidrug resistance gene.Adv Cancer Res ,1993;60:157