儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病细胞的DNA定量研究
中华儿科杂志 1999年第6期第37卷 论 著
作者：卢洁 谷仁凯 佟琳如 庞秀英 孙立荣 李学荣 董增义 宋如俊
单位：266003 青岛大学医学院附属医院儿科
关键词：白血病；淋巴细胞；急性；肿瘤；残留；DNA；聚合酶链反应；序列分析
【摘要】 目的 探讨定量监测儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）微量残留病（MRD）细胞DNA变化的临床意义。方法 采用5′端修饰引物，构建内参照竞争模板，建立竞争性聚合酶链反应（competitive polymerase chain reaction, CPCR）DNA(CPCR-DNA)定量法，对70例ALL患儿进行了T细胞受体（T-cell receptor，TCR）Vδ2Dδ3基因重排定性检测及完全缓解（CR）期MRD的动态定量研究。结果 (1)TCRVδ2Dδ3基因重排检出率：在70例ALL中占81%，48例B-ALL中占83%，4例T-ALL中占1/4，后两者比较差异有显著意义（P＜0.05）。(2)MRD-DNA定量监测显示：①随CR期延长（除CR＜3个月者），MRD水平呈逐年下降趋势，以CR 4～12个月MRD水平最高，并与骨髓复发呈正相关。②9例复发者于复发前平均7个月即出现MRD增高，分子水平的改变先于临床复发。③ALL持续完全缓解（CCR）3年以上，MRD持续转阴或持续≤0.05%，可作为终止化疗的可靠指标。结论 (1)建立了一种简捷、敏感、准确的CPCR-DNA定量法;(2)用该CPCR方法定量监测MRD变化，对判断疗效、预测复发、指导治疗和决定终止化疗时间有一定的临床意义。
Quantitative analysis of minimal residual disease cells DNA in children with acute lymphoblastic leukemia LU Jie, GU Renkai, TONG Linru, et al. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical School of Qingdao University, Qingdao 266003
【Abstract】 Objective To explore the clinical significance of quantitative analysis of minimal residual disease (MRD) cells DNA in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL).Methods By using the competitive polymerase chain reaction (CPCR) technique which was based on the 5′-terminal modified primers to obtain the internal standard template, the T-cell receptor (TCR)Vδ2Dδ3 gene rearrangements were detected in 162 bone morrow samples collected from 70 patients with ALL, and MRD-DNA were analysed quantitatively in patients with complete remission (CR).Results (1) The frequencies of TCR Vδ2Dδ3 rearrangements were 81% in ALL, 83% in B-ALL and 1/4 in T-ALL, respectively. (2)MRD-DNA was detected in 92 samples collected from 48 patients with CR, and the MRD showed a descending tendency year by year in the patients, but not the patients with CR less than 3 months. ① The highest MRD DNA level was found in the patients with CR of 4～12 months and showed a positive correlation with the relapse of ALL. ② MRD-DNA was elevated (＞0.05%) 7 months prior to the relapse. ③ The patients with continuous complete remission (CCR) over 3 years and with negative MRD or MRD≤0.05% persistently could be considered to terminate the chemotherapy.Conclusion The CPCR method was a simple, sensitive and accurate MRD-DNA quantitative method. It may play an important role in evaluating the chemotherapy efficiency, predicting relapse and prognosis and guiding clinical
【Key words】 Leukemia, lymphocytic, acute Neoplasm, residual DNA Polymeras chain reacction Sequence analysis
急性淋巴细胞白血病（ALL）微量残留病（MRD）的定量监测是治疗ALL的重要环节。本研究旨在建立一种简捷、实用的竞争性聚合酶链反应（competitive polymerase chain reaction, CPCR）-DNA定量方法，对ALL患儿MRD-DNA进行动态定量研究，以探讨MRD量的变化与临床疗效、复发、预后及终止化疗时间的相互关系。现将结果报告如下。
材料及方法
一、标本
经我院儿科诊治的70例ALL患儿，男48例，女22例；初诊年龄2～13岁，中位年龄7岁。70例ALL共收集162份新鲜骨髓液及骨髓涂片标本，参考Sambrook等［1］和Fey等［2］提供的方法提取骨髓DNA，测定其纯度及质量浓度（μg/ml）。
二、形态学和免疫学分型
按1980年和1986年全国白血病分类分型标准分型。采用间接免疫荧光技术，进行单克隆抗体（McAb）免疫分型，骨髓阳性细胞＞30%为阳性标准。B-ALL按六型分类法分型［3］，T-ALL按三型分类法分型［4］。
三、定性PCR反应
扩增TCR Vδ2Dδ3基因重排特异性引物序列［5］：
5′-TGG CCC TGG TTT CAA AGA CAA TTT CCA-3′
5′-TGC TTG CTG TGT TTG TCT CCT GAG GCA -3′
经PCR条件优化和扩增，特异性片断约250 bp。
四、CPCR方法
1.获取内参照竞争模板：根据在引物5′端外接序列不影响PCR扩增特异性的原理［1］，设计合成5′修饰引物，扩增PBR322质粒DNA，产物经低溶点agarose电泳及wizard PCR preps DNA purification kit(promage产品)纯化回收，获得内参照竞争模板，分装后在-20℃条件下保存备用。
2.标准曲线制作：取5 μg初发ALL患儿的骨髓DNA，以正常骨髓细胞DNA连续对数稀释后，分别与恒定量的内参照竞争模板扩增，产物电泳后，特异性条带分别为250 bp、476 bp，用GDS-UVP8000凝胶成像仪及分析软件进行吸光度定量分析。取已知对数稀释后DNA加入量的对数值与二种扩增产物吸光度比值的对数值作坐标图。用坐标图中指数增长稀释点的对数值（Y）及吸光度比值的对数值（X）进行直线回归分析，得到校准曲线（Y＝-0.482+5.623X，r=0.98, P＜0.001），用于MRD-DNA定量分析，其数值相当于骨髓中MRD细胞DNA占有核细胞DNA的比例。
五、PCR产物直接测序
为确定PCR产物中ALL细胞克隆的存在和了解TCR Vδ2Dδ3连接区序列变化及其意义，采用5′-Vδ2和3′-Dδ3引物进行PCR扩增［5］，随机抽样5例阳性PCR产物,进行纯化回收及测序。
结 果
一、形态学和免疫学分型
70例ALL中，L1型13例，L2型56例，L3型1例。52例ALL进行了免疫分型：B-ALL 48例，其中BⅠ型2例，BⅡ型2例，BⅢ型24例，BⅣ型17例，BⅤ型3例；T-ALL 4例，其中TⅡ 3例，TⅢ 1例。
二、基因重排检出率
在70例ALL中57例（81%），48例B-ALL中40例（83%），4例T-ALL中1例（1/4）检出TCR Vδ2Dδ3基因重排。T-ALL与B-ALL重排检出率比较差异有显著意义（χ2c=4.441,P＜0.05）。
三、MRD-DNA定量监测
根据CR期不同，将48例CR期ALL的92份骨髓标本分成5个组:(1)诱导治疗结束至CR＜3个月者26例；(2)CR 4～12个月者18例；(3)CR 13～24个月者16例；(4)CR 25～36个月者8例；(5)CR＞36个月24例。
1.以CR期MRD水平≤0.05%和＞0.05%来区分分子效应的好（good molecular responder，GMR）与差（bad molecular responder，BMR）。5个CR组的GMR比例及MRD均值见表1。经统计学分析，差异有非常显著意义（秩和检验，H=26.23，K=5，P＜0.001）。组间两两比较，(2)(3)组高于(5)组，P＜0.01和0.05；(2)组高于(1)组，P＜0.05。
表1 ALL患儿不同CR期的MRD-DNA定量结果(
±s)
| 组别 |
CR时间(月) |
标本例数 |
GMR(%)* |
MRD-DNA(%)**(±s) |
|
1 |
＜3 |
26 |
46 |
0.22±0.06 |
| 2 |
～12 |
18 |
6 |
0.74±0.12 |
| 3 |
～24 |
16 |
19 |
0.63±0.15 |
| 4 |
～36 |
8 |
38 |
0.09±0.02 |
| 5 |
＞36 |
24 |
67 |
0.10±0.03 |
注：* GMR%表示：分子效应好的(MRD≤0.05%)占本组的比例；** MRD-DNA%表示：骨髓残留白血病细胞DNA占有核细胞DNA的比例 2.本研究92份骨髓标本中有57份MRD＞0.05%（占62%），随访2年，其中9例（16%）于受检后1～11个月（平均7个月）复发并5例死亡；而MRD≤0.05%有35份（占38%），受检后2年内无复发病例。两组间复发率比较差异有显著意义(χ2c=4.4671，P＜0.05)。
3.诱导治疗结束至CR 3个月以内MRD检测：在26例受检者中，有14例(54%) MRD＞0.05%，其中7例（50%）在治疗过程中复发并2例死亡；而MRD≤0.05%的12例(46%)中，仅有1例（8%）于CR 74个月时复发，两组复发率比较差异有显著意义（精确概率计算，P=0.028）。
4. 24例持续完全缓解（CCR）36个月以上，其中5例MRD转阴（MRD＜1/10-6），19例仍可检出MRD。19例中11例至今达CCR（MRD≤0.05%）；19例中8例MRD＞0.05%，其中有2例追踪监测3次以上，MRD由转阴或由低水平转为升高，分别于受检后3、6个月复发并死亡；6例MRD持续较高水平中1例复发，目前均在治疗和监测中。
四、TCR Vδ2Dδ3连接区测序
5例ALL（2例初发、3例CR期）进行了TCR Vδ2Dδ3连接区测序，显示了高的基因重排频率（100%）和细胞克隆的同源性。3例CR者存在TCR Vδ2-Dδ2连接区序列及heptamer区序列［6］，有Dδ3序列部分缺失。2例初发者有Dδ2序列部分缺失。5例均未显示Dδ1序列。
讨 论
一、关于CPCR方法
如何定量监测MRD，一直是人们探讨的问题。文献中报道的MRD定量方法多较为复杂，CPCR方法，由于待测模板与内参照模板序列相同或相近，易形成异源双链，影响了精确定量。我们建立的CPCR-DNA定量法的特点：(1)构建的内参照模板与待测模板，不需要酶切，经电泳即可区分；(2)扩增时避免了试管间的差异和上述异源双链现象，定量精确度高（敏感度为10-6），足以检测5 pg以下的靶序列DNA；(3)能迅速的鉴别假阴性；(4)方法简捷，经一轮PCR即可完成，免去了放射性同位素杂交等繁琐过程，可对临床大量样本进行MRD定量，适合临床应用。
二、结果分析
1. CR期MRD动态监测结果表明：(1)随着ALL的CR期延长，MRD水平呈现一定的规律性变化。除CR＜3个月者，MRD呈逐年下降的趋势，以CR 4～24个月MRD水平最高，并与骨髓复发呈密切正相关。提示，此期需要加强治疗，定期监测，以防复发。(2)本组有9例ALL于临床复发前平均7个月即出现MRD的增高，提示分子水平的改变先于临床复发。为了能早期预测复发及时治疗，定量监测MRD时间间隔应不超过3～6个月。(3)对诱导治疗结束后26例ALL进行MRD定量检测，发现MRD＞0.05%组的复发率显著高于MRD≤0.05%组（P＜0.05）。说明此期定量监测MRD，对预测复发及预后有重要意义，与Jacquy等［7］研究结果相一致。
2.文献中报道，ALL达CCR的患儿，甚至终止化疗后2～35个月仍可存在MRD，认为MRD的根除并非ALL治愈的先决条件［8］。如何确定终止化疗时MRD的水平，仍有待于探讨。本组CCR达36个月以上者中，有11例MRD未能转阴，但至今达CCR。提示MRD减少到一定数量时可能化疗难以产生有效的清除作用。此类患儿有可能依靠自身免疫功能逐渐清除这些残存的白血病细胞而不复发［9］。认为ALL患儿CCR达3年以上、MRD持续转阴或持续≤0.05%，可作为终止化疗的可靠指标之一。由此可缩短CCR患儿的化疗时间及减少不必要的化疗副作用。
3.PCR产物直接测序显示了TCR Vδ2Dδ3连接区序列的重排和缺失，其改变与ALL分型及预后的关系，尚待增加病例进一步深入研究。
本课题由山东省教委资助（项目编号：鲁教科字1996-44J96K52）
参考文献
1 Sambrook J, Fritsch EF, Maniaatis T. Molecular cloning: a laboratory manual.2 nd. New york: Cold Spring Habor Laboratory. 1989.77:1588.
2 Fey MF, Pilkingtin SP, Summers C, et al. Moleculor diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides. Br J Haematol, 1987, 67:489-491.
3 Drexler HG, Gignac SM, Minowada J. Routine immunophenotyping of acute leukemia. Blut, 1988, 57:327.
4 Reinherz EL, Kung PC, Goldstein G, et al. Discrete stags of human intrathymic differeneiation : analysis of normal thymocytes and leukamic lymphoblasts of lineage. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77:1588.
5 Cave H, Guidal C, Rohrlich P, et al. Prospective monitoring and quantitation of residual blasts in childhood acute lymphoblastic leukemia bypolymerase chain reaction study of δ and γ T-Cell receptor genes. Blood, 1994, 83:1892-1902.
6 Shouhei Y, Thomas E, Hanaen H, et al. T-Cell receptor δ gene recombination in common acute lymphoblastic leukemia：preferential usage of Vδ2 and requent involvement of the J α cluster. Blood, 1991, 77:141-148.
7 Jacquy C, Delepaut B, Van S, et al. A prospective study of minimal residual disease in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukaemia: MRD level at end of induction is a strong predictive factor of relapse. Br J Haematol, 1997, 98:140-146.
8 Willam MR, Zeev E ,Mala V ,et al. Measurment of residual leukemia during remission in childhood acute lymphoblastic leukemia. N Engl Med, 1997, 336:317-323.
9 Nizet Y, Van Daele S, Lewalle P, et al. Long-term follow-up of residual disease in acute lymphoblastic leukemia patients in complete remission using clonogeneic IgH probes and the polymerase chain reaction. Blood, 1993, 82:1618-1625.
(收稿：1998-08-17 修回：1999-01-19)
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