周期蛋白D3在小儿急性白血病细胞中的表达及其作用研究
中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著
作者：张乐萍 李静
单位：100044北京医科大学附属人民医院儿科
关键词： 细胞周期蛋白类；白血病；寡核苷酸；反义；儿童
摘要 目的检测周期蛋白D1、D2、D3在小儿急性白血病细胞中的表达，并研究周期蛋白D3在小儿急性白血病发病机制中的作用。方法采用免疫组织化学法检测43例急性白血病患者白血病细胞和3种白血病细胞系中周期蛋白D的表达；用反义技术和流式细胞术研究周期蛋白D3在白血病细胞增殖中的作用。结果小儿急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病细胞中周期蛋白D3阳性表达率分别为47％和38％，急性白血病患者中周期蛋白D1阳性表达率约为5％，周期蛋白D2表达均为阴性，正常对照组骨髓细胞周期蛋白D1、D2、D3表达均为阴性。周期蛋白D3在白血病细胞系CEM细胞中表达阳性，用周期蛋白D3反义脱氧寡核苷酸与CEM细胞共培养后，细胞增殖受到抑制。结论周期蛋白D3在小儿急性白血病细胞中呈现过度表达，并对白血病细胞增殖产生重要影响。
Expression and role of cyclin D3 in childhood acute leukemia
ZHANG Leping, LI Jing
Department of Pediatrics,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044
Abstract Objective To investigate the expression and role of cyclin D in childhood acute leukemia(AL). Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of cyclin D1， D2， D3 in 43 samples of childhood AL patients and three leukemic cell lines. Cyclin D3 antisense oligodeoxynucleotides were used in in vitro culture study. Results Cyclin D3 expression was positive in 47％ (14/30) of the childhood acute lymphoblastic leukemia and 38％ (5/13) of the acute myelogenous leukemia patients and in CEM cells. Cyclin D1 was overexpressed in 5％ (2/43) of the AL patients. No overexpression of cyclin D2 was detected.Incubation of CEM cells with cyclin D3 antisense oligodeoxynucleotides resulted in inhibition of cell proliferation. Conclusion Cyclin D3 was overexpressed in childhood AL and it played an important role in the proliferation of leukemic cells.
Key words Cyclin Leukemia Oligodeoxynucleotide， antisense Children
肿瘤的发生、发展与细胞周期调控的分子机制联系异常紧密。在细胞增殖周期的G1期起主要正性调节作用的周期蛋白D有3个亚型，已发现周期蛋白D1、D2在多种实体瘤中呈现阳性表达[1-3]，但周期蛋白D3与小儿急性白血病的相关研究鲜有报道，我们旨在探讨周期蛋白D与小儿急性白血病细胞增殖的关系。
对象和方法
1 研究对象 急性淋巴细胞白血病(ALL)30例，其中高危型16例，标危型14例；急性非淋巴细胞白血病(ANLL)13例。以上均为初治患者，年龄17个月～14岁。白血病细胞系CEM(T淋巴细胞白血病细胞系)、HL60和K562细胞由军事医学科学院提供。10例免疫性血小板减少性紫癜患者骨髓为对照。
2 免疫组织化学染色检测小儿急性白血病细胞中周期蛋白D1、D2、D3的表达 取急性白血病及免疫性血小板减少性紫癜患者骨髓穿刺液涂片、固定，经正常马血清封闭后加周期蛋白D1、D2、D3单克隆抗体（CloneDCS22,美国Neomarkers公司，1∶50稀释），40℃过夜。按SAP试剂盒说明操作，BCIP/NBT显色，甲基绿衬染。封片后光镜下观察，计数500个细胞，阳性细胞≥5％者计为阳性表达[2]。用PBS代替一抗作为阴性对照。
3 检测白血病细胞系中周期蛋白D3的表达 取CEM细胞、HL-60细胞、K562细胞涂片，检测方法同上。
4 周期蛋白反义脱氧寡核苷酸对CEM细胞生长的影响
4.1 硫代脱氧寡核苷酸：针对周期蛋白D3基因转录起始部位的反义脱氧寡核苷酸（ASON）和对应的正义脱氧寡核苷酸（SON）购于美国Cybersyn公司，均经过全硫代修饰，序列为：ASON 5'-ACACAGCAGCTCCATACTCG-3'，SON 5'-CGAGTATGGAGCTGCTGTGT-3'。
4.2 细胞培养：CEM细胞分为ASON、SON和空白对照3组，置于37℃、体积分数为5％的CO2、饱和湿度的孵箱中培养，培养液为RPMI1640、体积分数为10％的胎牛血清、105U/L青霉素、0.1g/L链霉素。于加入脱氧寡核苷酸前24小时将体积分数为10％的胎牛血清换成体积分数为2％的胎牛血清。ASON组和SON组分别加入10mmol/LASON和SON，每24小时加样1次，连续3次。
4.3 生长曲线记录：从加入ASON和SON前开始记录每组活细胞数目，细胞活性检测采用台盼蓝拒染法，以后每12小时记录1次，每组记录3份样本，计算平均值，绘制生长曲线。
4.4 流式细胞术测定周期蛋白D3表达水平：分别取ASON、SON处理72小时细胞以及空白对照组细胞检测，具体操作参照文献[4]。
4.5 细胞周期测定：分别取处理72小时细胞104个，体积分数为70％的冷乙醇固定，10g/L碘化乙锭染色后，FACScan流式细胞仪检测。
5 统计分析采用四格表确切概率法。
结果
1 急性白血病患儿周期蛋白D表达情况 10例对照组周期蛋白D1、D2、D3表达均为阴性。30例ALL中周期蛋白D3表达阳性14例，阳性率为47％，其中高危ALL16例中有11例阳性，阳性率为69％，标危ALL14例中有3例阳性，阳性率21％，二者相比差异有显著性（P0.05）。30例ALL中仅2例周期蛋白D1表达阳性，阳性率约7％。30例ALL患儿周期蛋白D2表达均阴性。13例ANLL中有5例出现周期蛋白D3阳性表达，阳性率38％，周期蛋白D1、D2表达均为阴性。
2 白血病细胞系周期蛋白D3表达情况 CEM和HL60细胞中周期蛋白D3表达阳性，其中CEM细胞表达水平高，K562细胞中周期蛋白D3表达阴性。
3 周期蛋白D3ASON对CEM细胞生长的影响
3.1 生长曲线：与空白对照组相比，SON组细胞增殖未受明显影响，而ASON组细胞增殖受到抑制，细胞数目增加明显减慢（图1）。
图1 周期蛋白D3ASON对CEM细胞增殖能力的影响
3.2 周期蛋白D3ASON对CEM细胞表达周期蛋白D3的抑制作用：与空白对照组（荧光强度为38.31)相比，SON组细胞表达周期蛋白D3水平(荧光强度为30.56)轻度下降，而ASON组各时相细胞表达周期蛋白D3水平(荧光强度为17.59)均明显下降。
3.3 细胞周期测定：空白对照组G0/G1期细胞所占比例为36.7％，SON组为32.6％，ASON组为56.6％，ASON组G0/G1期细胞所占比例较前两组增大，而代表增殖活跃的S期和G2/M期细胞所占比例相对减小。
讨论
细胞增殖周期调控异常与肿瘤细胞的恶性增殖关系密切，在一个细胞周期中至少有两个节点控制着细胞能否进入下一个时相，一个位于G1-S处，另一个位于G2-M处，节点的功能是保证基因组复制和分离的忠实性。节点功能异常时，DNA损伤的细胞不能被阻滞，直接进入S期，从而引起癌变[5]。细胞周期中最重要的一个节点位于G1-S期，又称为起始点。周期蛋白D是G1-S节点的主要正性调节因子，它有3个亚型即D1、D2、D3，3个亚型的序列有明显的同源性，但它们之间的异同之处尚未完全明确[6]。已证实周期蛋白D1与淋巴瘤[7]、周期蛋白D2与慢性B淋巴细胞白血病[3]之间关系密切，但它们与小儿急性白血病的关系尚未见报道，特别是有关周期蛋白D3的报道甚少。
我们对43例急性白血病患儿初治骨髓标本均同时检测3种周期蛋白D表达，结果显示在小儿ALL和ANLL中周期蛋白D3表达阳性率明显增高，其中高危型ALL周期蛋白D3阳性率显著高于标危型患儿，提示周期蛋白D3与小儿急性白血病关系密切，且周期蛋白D3可以作为小儿ALL高危因素之一。周期蛋白D1、D2在小儿急性白血病细胞中表达率很低。
为了进一步了解周期蛋白D3在小儿急性白血病发生机制中所起的作用，我们选择周期蛋白D3表达阳性的白血病细胞系CEM细胞与周期蛋白D3的ASON共培养，结果显示ASON组周期蛋白D3表达
下降的同时细胞增殖也受到抑制，细胞周期测定显示G0/G1期细胞所占比例增大，即细胞被阻抑在G0/G1期，说明周期蛋白D3是促进白血病细胞增殖的一个重要因素。
本实验结果一方面为周期蛋白D3促进白血病细胞增殖提供了临床及实验依据，另一方面说明在分子水平阻断周期蛋白D3表达能够将白血病细胞阻滞在G0/G1期，抑制其增殖。周期蛋白D3基因有希望成为基因治疗白血病的新靶点。
参考文献：
1 Barkova J,Lukas J,Muller H,et al.Abnormal patterns of D type cyclin expression and G1 regulation in human head and neck cancer.Cancer Res,1995,55:949-956.
2 van Diest PJ,Michalides RJ,Jannink L,et al.Cyclin D1 expression in invasive breast cancer. Correlations and prognostic value.Am J Pathol,1997,150:705-711.
3 Delmer A,Ajchenbaum-Cymbalista F,Tang R,et al.Overexpression of cyclin D2 in chronic B-cell malignancies.Blood,1995,85:2870-2875.
4 Gong J,Bhatia U,Tragas F,et al.Expression of cyclins A,D2 and D3 in individual normal mitogen stimulated lymphocytes and in MOLT 4 leukemic cells analyzed by multiparameter flow cytometry.Leukemia,1995,9:893-899.
5 张贵星，苗健，油书恒.细胞周期控制异常与癌变．国外医学肿瘤学分册，1996，23：86-88.
6 邱晓燕，杨贵贞.G1期细胞调节因子与细胞癌变.国外医学免疫学分册,1996，3:117-120.
7 Rosenberg CI,Wang F,Petty EM,et al.PRAD1,a candidate BCL1 oncogene:mapping and expression in centrocytic lymphoma.Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88:9638-9642.
收稿：1998-08-31修回：1999-04-05
校对：董文革
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