新维甲类联合γ干扰素对急性单核细胞白血病细胞增殖分化作用的体外研究

中华血液学杂志 1999年第1期第20卷 论著

作者：陈惠仁　孙关林　韩锐　李晶　陈珏　张芬琴　苏卉　邬维礼　王振义

单位：200025　上海第二医科大学、上海血液学研究所［(现在解放军空军总医院,北京　100035)、孙关林、李晶(现在镇江医学院附属医院)、陈珏、张芬琴、苏卉、邬维礼、王振义］；中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所(韩锐)

　　关键词： 维生素A酸类；干扰素Ⅱ型；白血病，单核细胞；细胞分化

　　【摘要】　目的　探讨新研制的维甲类查尔酮酸R 9158和YS 904012联合γ干扰素(IFN-γ)在急性单核细胞白血病分化疗法中的应用价值。方法　应用细胞形态学、四氮唑蓝(NBT)还原反应和非特异酯酶乙酸萘酚(DCE)、细胞分化免疫表型CD₁₄和CD₆₈、CFU-L集落形成抑制率等变化,体外研究其对6例急性单核细胞白血病患者白血病细胞的增殖分化作用。结果　经YS 904012联合IFN-γ处理后，单核细胞由原始阶段变成较成熟的单核细胞,NBT还原反应阳性率和DCE分别由23.4%和25.0%上升到61.5%和52.0%,CD₁₄和CD₆₈表达增强,CFU-L集落增殖明显受抑。通过比较, YS904012联合IFN-γ诱导细胞分化和抑制集落形成活性优于R 9158和全反式维甲酸联合用药组(P＜0.01)。结论　YS 904012联合IFN-γ诱导分化治疗单核细胞白血病可能有一定临床实用价值。

　　In vitro study on the effects of the novel retinoids combined with IFN-γ on the proliferation and differentiation of fresh acute monocytic leukemic cells　CHEN Huiren, SUN Guanlin,HAN Rui,et al.Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University, Shanghai 　200025

　　【Abstract】　Objective　To investigate the prospect for clinical use of novel retinoids YS 904012 and R 9158 in combination with IFN-γ in inducing differentiation of acute monocytic leukemia.Methods　The effects of novel retinoids with IFN-γ on the differentiation and clonal proliferation of fresh leukemia cell from 6 monocytic leukemia patients were studied in vitro. Cell morphological examination,nitro tetrazolium blue reduction test and DCE, expression of CD₁₄ and CD₆₈ and CFU-L were used in the study.Results　The primary leukemia cell,cultured with the combination of YS 904012 and IFN-γ,became more mature in morphology.The NBT reduction rate and DCE were increased from 23.4% and 25.0% to 61.5% and 52.0%， respectively. The expression of CD₁₄ and CD₆₈ was increased.The growth of the leukemic colony in semi-solid culture was markedly inhibited. The activity of YS 904012 combined with IFN-γ in inhibiting proliferation and inducing differentiation of monoblast was greater than that of R9158 or all-trans retinoic acid in combination with IFN-γ(P＜0.01).Conclusion　 The YS 904012 combined with IFN-γ is worthy of further study for clinical differentiation therapy of acute monocytic leukemia.

　　【Key words】　Retinoids　　Interferon　　 Leukemia,monocytic　　Cell differentiation

　　急性单核细胞白血病是临床疗效较差的白血病亚型,以往的工作中曾发现新研制的维甲类化合物YS 904012与γ干扰素(IFN-γ)联合具有较强的诱导U937细胞分化成熟的能力^［1］,为进一步研究其药用价值,我们应用新维甲类化合物联合IFN-γ对单核细胞白血病患者骨髓单个核细胞(MNC)进行体外诱导分化实验,现将结果报告如下。

　　材料和方法

　　1　细胞来源　新鲜单核细胞白血病细胞来自6例确诊为M₄、M₅的初发患者骨髓,其中男2例,女4例,中位年龄46.5岁(30～67岁)。4例M₅患者中骨髓原始细胞平均0.855(0.800～0.900),2 例M₄患者,骨髓原始单核细胞分别为0.610和0.530。

　　2　新维甲类化合物　新维甲类查尔酮酸R 9158和YS 904012由中国医学科学院药物研究所提供,系我国合成,用无水乙醇溶解,浓度为1 mmol/L,4℃冰箱保存,全反式维甲酸(ATRA)为上海第六制药厂产品。IFN-γ由上海生物制品研究所提供。

　　3　诱导分化实验　Ficoll液分离骨髓MNC,以5×10⁵/ml的细胞浓度和诱导分化剂共同培养,培养条件为RPMI 1640(含体积分数为15%的小牛血清),37℃、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度培养7天。此后,收集细胞检查它们分化指标的变化。

　　4　四氮唑蓝(NBT)还原反应　参照文献［2］方法。

　　5　细胞表面分化抗原CD₁₄和CD₆₈检测　CD₁₄和CD₆₈抗体系Pharmingen产品,用间接免疫荧光标记法,在流式细胞仪FACScan上检测,计数10000个细胞,计算阳性细胞百分率。

　　6　白血病细胞集落形成单位(CFU-L)抑制率　患者骨髓制成MNC悬液后,配制CFU-L培养体系,每毫升体系含1×10⁶细胞、双倍McCoy 5A培养液 0.5ml、PHA刺激的外周血条件培养液0.5ml,置37℃恒温箱中孵育24小时后,加入0.6%Agarose 1ml,混匀加入24孔板,每孔0.3ml。然后置37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养9天,并且计数≥40个细胞组成的集落(CFU-L集落数)。在CFU-L培养体系中分别加入不同维甲类化合物和IFN-γ共同培养,计算抑制率。

　　结果

　　1　新维甲类化合物和IFN-γ联合对单核细胞白血病患者MNC增殖的作用　在CFU-L集落抑制作用实验中,我们发现单用IFN-γ对MNC形成CFU-L也有抑制作用,不同维甲类化合物(10^-6mol/L)与IFN-γ(1000U/ml)合用有协同抑制作用。其中对例1和例6患者细胞作用明显,YS 904012联合组的协同作用最强(见表1，P＜0.01)。

表1　新维甲类化合物与IFN-γ联合对原代单核细胞白血病CFU-L的抑制作用

例号	CFU-L抑制率(%)
	IFN-γ	YS 904012	IFN-γ+YS 904012	IFN-γ+R 9158	IFN-γ+ATRA
1	64	21	90	79	51
2	65	18	80	71	68
3	54	50	67	55	48
4	59	10	72	70	64
5	46	26	65	51	51
6	59	51	91	80	78
±s	57.8±7.0	29.3±17.2	77.5±11.3	67.7±12.1	60.0±11.9

注:IFN-γ浓度1000U/ml;新维甲类化合物浓度10^-6mol/L

　　2　单核细胞白血病患者骨髓MNC经新维甲类化合物和IFN-γ联合处理后的分化

　　2.1　细胞形态的变化：单核细胞白血病患者骨髓MNC在维甲类和IFN-γ作用后,细胞形态发生改变,胞体变小,核浆比例降低,核染色质紧密。尤以YS 904012联合IFN-γ作用后的变化明显,表明药物诱导细胞向成熟阶段分化。

　　2.2　NBT还原反应和非特异酯酶乙酸萘酚(DCE)变化：经诱导剂处理后(维甲类化合物浓度为10^-6mol/L,IFN-γ浓度为1000U/ml),6例患者骨髓MNC的NBT阳性率均增加,不同联合用药组作用活性不同,以YS 904012联合IFN-γ组活性最强(P＜0.01),从对照的23.4%增至61.5%。与此相应，反映单核细胞功能成熟的DCE阳性率均提高, 以YS 904012联合用药组的协同作用最强(见表2)。6例患者骨髓MNC对药物联合作用后的反应有异质性,联合诱导后例1和例6反应明显,NBT阳性率分别从对照的19%和21%增加到52%和77%。

表2　新维甲类化合物与IFN-γ作用后患者MNC的NBT阳性率(%)和DCE阳性率(%)的变化

　　　　　注:IFN-γ浓度1000U/ml；新维甲类化合物浓度10^-6mol/L

　　2.3　单核细胞白血病患者骨髓MNC与诱导分化剂共同培养后,CD₁₄和CD₆₈表达均增强,它的反应与联合用药有协同关系,YS 904012联合用药组作用明显增强(表3，4)。单核细胞白血病患者之间存在较大异质性,各例对照组CD₁₄和CD₆₈表达相比程度不一。例1，2，6在对照组CD₁₄和CD₆₈表达较低的情况下,显示YS 904012联合用药组细胞成熟分化抗原CD₁₄和CD₆₈表达明显增强,CD₁₄表达分别从对照的5%，6%，3%增至35%，54%，27%；CD₆₈表达由对照的8%，7%，8%增至30%，28%，30%。

表3　新维甲类化合物与IFN-γ联合作用后对单核细胞白血病患者MNC CD₁₄表达的影响

例号	CD14表达阳性率(%)
	对照	IFN-γ	YS 904012	IFN-γ+YS 904012	IFN-γ+R 9158	IFN-γ+ATRA
1	5	9	8	35	13	11
2	6	30	8	54	48	42
3	26	58	30	70	52	63
5	18	26	20	41	37	40
6	3	20	2	27	29	25
±s	10.6±10.1	28.6±18.0	13.6±11.2	46.7±18.2	35.8±15.1	36.0±18.1

注:IFN-γ浓度 1000U/ml；新维甲类化合物浓度10^-6mol/L;例4未测

表4　 新维甲类化合物与IFN-γ联合作用后对单核细胞白血病患者MNC CD₆₈表达的影响

例号	CD68表达阳性率(%)
	对照	IFN-γ	YS 904012	IFN-γ+YS 904012	IFN-γ+R 9158	IFN-γ+ATRA
1	8	10	9	30	9	10
2	7	10	8	28	15	17
3	41	52	42	70	66	67
5	15	21	18	41	39	39
6	8	8	9	30	22	28
±s	15.6±14.1	20.2±18.5	17.2±14.4	39.8±18.5	30.2±18.9	32.2±20.1

注:IFN-γ浓度1000U/ml；新维甲类化合物浓度10^-6mol/L;例4未测

　　讨论

　　新研制的维甲类化合物查尔酮酸R 9158和YS 904012与ATRA化学结构不同,是一类新型的诱导分化剂^［3］。我们曾以具有原始单核细胞和幼稚单核细胞特征的U937细胞株为模型,发现维甲类化合物和IFN-γ具有协同诱导作用，促进U937细胞分化和抑制其集落形成,且以YS 904012联合IFN-γ活性最强^［1］。但是,U937细胞株仅反映单株的白血病细胞对诱导分化剂反应的情况,尚不能代表异质性较大的单核细胞白血病患者骨髓细胞的反应。我们以6例急性单核细胞白血病患者骨髓MNC为实验模型,结果发现,原代白血病细胞经新维甲类化合物和IFN-γ联合处理后,细胞向单核系的成熟阶段分化,细胞形态发生改变,胞体变小,核染色质由疏松变得紧密,CD₁₄和CD₆₈ 表达增强,CD₁₄为镶嵌在细胞膜蛋白上的磷酯成分,而随单核系细胞逐渐成熟CD₁₄表达的量相应增加^［4］。CD₆₈为完整的TYPE1 膜蛋白,在较成熟的单核-巨噬细胞膜上有高表达^［5］。反映单核细胞功能成熟的NBT和DCE阳性率增加。通过比较,YS 904012组诱导分化的活性明显强于其它组(P＜0.01)。新维甲类化合物联合IFN-γ能明显抑制原代单核细胞白血病细胞集落形成,在抑制细胞增殖中,IFN-γ起重要作用。Testa等^［6］报道单用IFN-γ对U937细胞增殖活性具有很强的抑制作用,我们的实验显示，单用IFN-γ具有较强抑制原代单核白血病细胞CFU-L形成作用。联合用药后,抑制活性更强,YS 904012联合IFN-γ作用后抑制作用最强。

　　我们的研究证明，新维甲类化合物联合IFN-γ能体外协同诱导单核细胞白血病的细胞分化成熟,抑制集落形成,该结果与我们以往对U937细胞株为模型所获结果相似。6例单核细胞白血病患者MNC对药物联合处理后的诱导分化反应存在异质性,例1，2和例6经联合诱导后反应明显。尤其是对单核细胞白血病的细胞分化作用YS 904012联合用药组优于ATRA联合用药组。此结果在白血病治疗学上有新的启发意义,可能为挖掘单核细胞白血病分化疗法的用药提供实验依据。

　　本课题受国家自然科学基金(39470418)、国家九五攻关课题基金(96-906-01-17)及胡应洲奖励基金资助

　　参考文献

　　[1]　陈惠仁,孙关林,韩锐,等.新维甲类化合物联合IFN-γ对U937细胞株增殖分化作用及其机制的研究.中华血液学杂志, 1998,19:70-73.

　　[2]　Peck R , Biollag W. Potentiation of retinoid induced differentiation of HL60 and U937 cell line by cytokines. Eur J Cancer, 1991,27:53-57.

　　[3]　陈惠仁,孙关林,韩锐，等.新维甲类化合物对早幼粒细胞白血病和正常造血增殖分化作用的体外研究.中华血液学杂志,1997,18:65-68.

　　[4]　Simmons DL,Tan S, Tene DG ,et al. Monocytic antigene CD₁₄ is a phospholipid anchored membrane protein.Blood,1989,73:284-289.

　　[5]　Stroble H,Scheinecke C,Osmopits B,et al.Flow cytometric analysis of intracellular CD₆₈ molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br J Haematol, 1995, 90:774-782.

　　[6]　Testa U,Ferbus D,Gabbianelli M,et al.Effects of endogenous interferons on the differentiation of human monocyte cell line U937. Cancer Res,1988,48:82-87.

收稿：1998-02-02　　修回：1998-07-13

　　(校对：徐丽娟)