急性淋巴细胞白血病化疗缓解后TCRγ基因检测的意义

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：刘乐宇　孙金英　殷慧君

单位：100044　北京医科大学人民医院儿科

　　关键词： 白血病，淋巴细胞性，急性；残留白血病细胞；基因重排

　　摘要　目的：定量检测急性淋巴细胞白血病化疗效应差异及其临床意义。方法：应用竞争性PCR技术，定量检测急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞中T细胞受体γ(TCRγ)基因重排。结果：检测ALL患者54例158份骨髓标本，随访时间中位数为33.5个月。临床缓解时36例患者的白血病细胞＜1×10^-5，18例为(354±327)×10^-5。诱导缓解期的杀伤效应与缓解早期的残留白血病细胞数量显著相关，并与临床复发相关。部分患者缓解后残留白血病细胞数量持续小于1×10^-5且临床无复发。结论：白血病化疗效应差异显著，化疗效应的定量评价有助于制定个体化的治疗方案。

　　Detection of TCRγ gene in acute lymphoblastic leukemia after remission and its clinical significance　Liu Leyu, Sun Jinying, Yin Huijun. Pediatric Department of People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing　100044

　　Abstract　Objectives: To investigate the quantitative evaluation of chemotherapy efficiency in patients with acute leukemia and its clinical significance. Methods: Clonal rearrangement of T-cell receptor γ gene in ALL was detected quantitatively by using competitive PCR. Results: One hundred and fifty-eight samples were collected from 54 childhood ALL. The median follow-up duration was 33.5 months. At remission, the amount of leukemic cells in 36 cases was less than 1×10^-5, and in 18, was (354±327)×10^-5. The efficiency of induction therapy was related significantly to the amount of the detectable residual leukemic cells in the early remission phase and to clinical relapse. In some patients in remission,the amount of leukemic cells persistently under 1×10^-5 without clinical relapse. Conclusion: Quantitative evaluation of the chemotherapy efficiency is helpful for individualized treatment.

　　Key words　Leukemia, lymphoblastic, acute　　Residual leukemic cell　　Gene rearrangement

　　目前，大多数的小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)可以通过大剂量化疗而得到治愈。然而，化疗的疗程通常为2～3年，还可产生许多与药物相关的不良反应，使治愈后生存质量较低。制定个体化的化疗方案可能是解决上述问题的重要途径之一。我们试图对白血病的化疗效应进行定量评价，探讨白血病个体化治疗的可行性。

病例和方法

　　1　患者及标本　1989～1996年我科收治的66例儿童ALL患者。其中男41例，女25例。免疫分型T-ALL8例，早期前B-ALL和前B-ALL共58例。患者按大剂量化疗方案进行治疗^［1］。收集不同治疗时期患者骨髓标本，用常规方法提取DNA。

　　2　聚合酶链反应(PCR)扩增及白血病克隆确定^［2］　取患者标本DNA 1μg按常规进行PCR扩增。TCRγ基因在多数ALL细胞中呈现出克隆性重排。通过对TCRγ基因PCR产物的限制性内切酶类型分析可确定白血病克隆。如果某一患者的初诊标本与缓解期标本DNA的PCR产物呈现出一致的酶切类型，则证明患者在缓解期体内有微量残留白血病细胞，并进一步进行定量分析。

　　3　DNA序列分析及312bp缺失性竞争片段的合成　我们所用引物的PCR产物为400bp片段。在3%低熔点琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，按常规方法进行纯化，回收扩增产物，并用双脱氧末端终止法进行DNA序列测定，证实为TCRγ基因的Vγψ₇-Jγ₁重排，其中含有2个限制性内切酶HaeⅢ位点(序列资料省略)。经该酶消化后可产生3个DNA片段(38，88和274bp)。取2μl纯化PCR产物，在20μl的反应体系中用Hae Ⅲ 5U在37℃消化1小时。取酶切产物5μl在20μl反应体系中用T₄ DNA 3U 16℃反应10小时。取连接产物5μl再次PCR扩增。用低熔点胶方法回收新产生的312bp(38bp+274bp)缺失性竞争片段，作为内源性竞争片段进行竞争性PCR。分装后在-20℃条件下长期保存。

　　4　竞争性PCR对白血病细胞定量及检测敏感性测定^［3］　将1μg CEM细胞系(T-淋巴细胞白血病细胞系)DNA进行对数稀释后，在恒定量的缺失性片段存在的情况下按上述条件进行PCR共扩增，并用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。经银显色后(Promega公司提供银染试剂盒)可见312bp扩增带的吸光度随CEM DNA加入量的减少(相应的400bp扩增带的吸光度因此也减少)而逐渐增加，呈现出明显的竞争关系(附图)，并可见在CEM DNA被稀释到10^-5时，仍有可明确分辨出的扩增带。即本方法检测残留白血病细胞的敏感性为10^-5。用图像分析仪(IBAS 2000，德国)进行PCR结果定量分析，以CEM DNA加入量的对数值与400bp和312bp吸光度比值的对数值作图，制出标准曲线。当待测患者DNA标本在同样的条件下同时进行扩增时，该标准曲线便可以用于患者标本中白血病细胞的定量检测。残留白血病细胞定量的数值代表白血病细胞占有核细胞的比例。

　　1～7表示CEM DNA 1μg经1∶(10⁰～10⁶)倍比稀释后加入；M为标志pBR322-HaeⅢ。本图结果经图象及统计学分析后获得标准曲线Y=0.319-0.133X,r=0.997,P＜0.01，用于定量分析

附图　竞争性PCR

结果

　　1　白血病大剂量诱导缓解治疗效应的定量评价　在ALL患者66例中，有54例被证实存在有白血病性克隆性重排的TCRγ基因。这些患者治疗前平均白血病细胞数占0.824。在临床缓解时，有36例PCR检测结果为阴性（即残留白血病细胞数量小于1×10^-5)。另18例PCR检测为阳性，白血病细胞定量结果为(354±327)×10^-5。

　　2　白血病缓解期治疗效应的定量评价　54例患者在临床完全缓解后随访时间的中位数为33.5个月(1～75个月)，在此期间共收集到158份骨髓标本。其中有32例患者的62份缓解后不同时期骨髓标本被检测出残留白血病细胞。在临床缓解时PCR检测为阴性的36例患者中，有14例患者在以后的随访中至少有1次骨髓标本为PCR检测阳性，其中2例临床复发。而临床缓解时PCR检测结果为阳性的18例患者，被随访的17例中均至少有1次PCR检测阳性，其中5例患者临床复发。

　　临床缓解后不同时期残留白血病细胞定量结果见附表。在缓解后的早期，临床缓解时PCR检测阴性组病例的白血病细胞数量明显低于临床缓解时PCR检测阳性组的病例［(121±34)×10^-5 vs (285±130)×10^-5，P ＜0.001］，并且具有较高的PCR检测转阴率和较低的复发率(P＜0.01)。而对于长期临床缓解的患者，两组残留白血病细胞数量无显著差异(P＞0.05)。

讨论

　　白血病患者在临床缓解后较长的一段时间内，残留白血病细胞的检测结果可持续为阳性。目前的研究表明，单纯对残留白血病细胞进行定性检测，并不能准确反映患者的状态。我们应用竞争性PCR的原理，建立了定量检测白血病细胞克隆性重排的TCRγ基因的方法，探讨应用残留白血病细胞定量方法来指导白血病临床化疗的可能性。但需要指出的是，我们建立的方法仅是对TCRγ基因进行定量分析，只能部分地反映出患者的残留白血病状态。如果能利用这样的技术同时定量检测其它标志基因，如检测ALL免疫球蛋白重链基因重排，将可能更为全面。

附表　缓解后不同时期残留白血病细胞定性及定量检测结果

　　注：显著性检验P值为同列中对应值的比较　　我们的研究表明，ALL患者对白血病治疗的反应性有明显差异。患者经大剂量诱导缓解治疗达到临床缓解时，66.7%的患者可获得5个对数级的白血病杀伤效应(残留白血病细胞定量小于1×10^-5)，而部分患者仅获2～3个对数级［残留白血病细胞数为(354±327)×10^-5］的杀伤效应。诱导缓解治疗的效应对缓解期患者体内的残留白血病细胞数量有明显影响：在诱导缓解治疗阶段白血病细胞负荷消减较少(2～3个对数级)的患者，缓解后早期残留白血病细胞的数量较高且有较高的复发危险性，PCR检测转阴率亦较低；而临床缓解后获得5个对数级以上杀伤效应的患者，情况相反，甚至27.8%的患者在临床缓解后残留白血病细胞检测长期持续性阴性且临床无复发。对后者如果在临床上仍采取较强的化疗方案，可能会给患者带来许多不必要的不良反应。

　　目前认为，大剂量化疗用于ALL的主要作用是减少白血病细胞负荷量，而不能清除残留白血病细胞^［4］。我们的结果亦发现，缓解2年和3年的患者体内残留白血病细胞数无显著的差异。然而，我们的研究还表明，如果在诱导缓解期白血病细胞杀伤效应大于5个对数级，则可明显地减少临床缓解期残留白血病细胞的数量，增加PCR的转阴率及减少临床复发的机会。因此，在白血病治疗的初期，应当通过大剂量、密集的化疗最大限度地杀伤白血病细胞，以达到5个对数级以上的杀伤效应，而对于长期缓解的病例，如果残留白血病细胞定量检测的结果为持续低水平，应避免强化疗而选用其它疗法，如免疫治疗^［5］等。由此可见，定量评价白血病细胞杀伤效应是十分有意义的。

　　本课题受卫生部青年（启动）基金资助

参 考 文 献

　　1　殷慧君. 急性淋巴细胞白血病的化学治疗. 见：殷慧君 主编. 小儿急性白血病化学治疗. 北京：科学出版社，1995. 55-71.

　　2　Taylor JJ, Rowe D, Williamson IK, et al. Detection of T cell receptor gamma chain V gene rearrangements using the polymerase chain reaction: application to the study of clonal di-sease cells in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1991, 77: 1989-1995.

　　3　Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucl Acids Res, 1993, 21: 2017-2018.

　　4　Dwenger A, Lindemann A, Metelsmann R. Minimal residual disease: detection, clinical relevance, and treatment strategies. J Hematother, 1996, 5: 537-548.

　　5　Caron PC, Scheinberg DA. Immunotherapy for acute leukemias. Curr Opin oncol, 1994, 6: 14-22.

(收稿：1997-08-28　　修回：1998-02-12)

(校对：张吉贤)