急性白血病骨髓基质细胞肿瘤坏死因子α分泌活性及其意义

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：侯丽君　翟明　卢香兰

单位：110001　沈阳，中国医科大学第一临床学院血液研究室

　　关键词： 白血病，急性；骨髓基质细胞；肿瘤坏死因子

　　摘要　目的：探讨急性白血病(AL)骨髓基质细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)分泌活性。方法：应用体外骨髓基质细胞培养法及TNFα生物活性检测法，对AL患者20例及正常对照者10名的骨髓基质细胞培养上清中的TNFα活性水平进行检测，并同步检测了患者血清、骨髓白血病细胞培养上清中的TNFα活性。结果：AL骨髓基质细胞形成能力较差，但其TNFα活性明显高于对照组(P＜0.05)；少部分急性髓系白血病(AML)骨髓白血病细胞能自发分泌TNFα；患者血清中的TNFα活性显著高于正常对照(P ＜0.001)。结论：AL患者骨髓基质细胞存在量和质的异常，TNFα的异常分泌可能是导致AL增殖的一个重要因素。

　　Secretive activity of tumor necrosis factor α(TNFα) of marrow stromal cells in acute leukemia and its clinical significance　Hou Lijun, Zhai Ming, Lu Xianglan. Laboratory of Hematology, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang　110001

　　Abstract　Objective:To investigate the TNFα secreting activity of marrow stromal cells in acute leukemia. Methods:TNFα in vitro culture supernate of marrow stromal cells from 20 acute leukemia patients and 10 normal controls was detected. TNFα activities in patients and control serum and in patients leukemic cell culture supernate were also detected. Results: TNFα activity in leukemic stromal cell supernate was significantly higher than that of the control (P＜0.05). Some AML cell could spontaneously secret TNFα. Serum TNFα activity of the patient group is also evidently higher than that of the control group (P＜0.001).Conclusion: There were qualitative and quantitative defects of marrow stromal cells in acute leukemia patients. Increased secretion of TNFα is probably an important factor leading to the abnormal proliferation of acute leukemia cells.

　　Key words　Leukemia，acute　　Marrow stromal cell　　Tumor necrosis factor

　　急性白血病(AL)是一种恶性增殖的克隆性疾病，其增殖机制尚未被阐明。一些研究表明，以细胞因子为中心的细胞增殖调节机制和细胞应答出现异常很可能是其增殖的重要原因之一。认为其自身可以分泌一些细胞因子，同时也受到来自骨髓造血微环境中的细胞因子的影响。构成骨髓造血微环境的核心是骨髓基质细胞，骨髓基质细胞是由成纤维细胞、内皮细胞及脂肪细胞、巨噬细胞等构成，既能分泌多种细胞刺激因子调节细胞增殖，也能分泌象干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)及肿瘤生长因子β等一些抑制因子来维持造血功能的平衡状态^［1］。AL骨髓基质细胞形成能力及细胞因子分泌能力均有一定改变^［2，3］。我们应用体外细胞培养及TNFα的生物活性检测方法，对25例AL患者进行体外基质细胞培养，对其中有基质细胞形成的20例AL患者及10名正常人骨髓基质细胞培养上清液TNFα活性进行检测，并同步对这些患者血清及骨髓白血病细胞自发分泌进行检测，以期探讨AL骨髓基质细胞TNFα分泌活性及其在AL细胞增殖过程中的作用。

病例和方法

　　1　研究对象　AL患者20例，均为初诊。其中急性髓系白血病（AML）15例（M₂2例，M₃3例，M₄3例，M₅6例，M₆1例），急性淋巴细胞白血病(ALL)5例（均为L₂型）。年龄16～66岁，男12例，女8例，近2周内无发热。正常献髓者10名，男6名，女4名，年龄20～51岁。

　　2　细胞培养及标本采集

　　2.1　血清标本采集：取静脉血3ml，离心取上清，经56℃、30 分钟灭活后于－20℃保存待测。

　　2.2　骨髓基质细胞培养及其上清制备：肝素抗凝无菌试管采集骨髓液3ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC）后洗涤3次，台盼蓝染色，将细胞活性＞95％，且白血病细胞＞90％的样本配成细胞浓度为1×10⁵／ml，含RPMI 1640、15 ％小牛血清的白血病细胞悬液置于37℃、5％CO₂培养箱内，培养24小时后取上清液待测。

　　2.3　骨髓基质细胞培养及其上清液采集：按Whitlock-Witte 培养法^［4］略加改良。用35mm培养皿，将从骨髓液中分离的骨髓MNC浓度调至1×10⁵／ml，注入含有15％小牛血清、2×10^-6mol／L甲基泼尼龙（MP）、100U／ml 白细胞介素3(IL-3)的RPMI 1640培养液内，放入37℃、5％CO₂培养箱内培养。培养的第1～2周，每周2次半量换培养液，同时观察基质细胞形成情况。第2周后骨髓基质细胞基本形成，开始全量换培养液，并除去全部悬浮细胞，于第4 周基质细胞生长较旺盛时采集培养上清液。

　　3　TNFα活性测定　取24小时龄L929细胞，细胞浓度为1×10⁵／ml，以每孔100μl加入96孔板中培养24小时，弃上清后加入不同浓度的样本（1∶1；1∶50； 1∶100），并设3个平行孔，最后加入放线菌素D至终浓度为1mg／L，继续培养24小时，弃去培养液后加0.5％结晶紫液染色15分钟，洗板3次，再加入20 ％乙醇溶解后在酶标仪上测定570nm处吸光度（A，曾称光密度OD）。每块板同时设有空白对照、 阴性对照及标准TNFα试剂对照孔。各样本A值取其3孔的均值，并减去空白对照，再求出各样本中TNFα细胞毒活性值（CT），以细胞杀伤百分率表示。

结　果

　　1　AL骨髓基质细胞生长状态及TNFα分泌活性

　　1.1　生长状态：AL组骨髓基质细胞于培养第1周出现，呈梭形、椭圆形、三角形等多种形态零散分布；2～3周，基质细胞数开始增多；4周时，细胞生长比较旺盛，有融合趋势。用吉姆萨染色法染色，可见成纤维细胞、巨噬细胞及脂肪细胞等。而正常对照组基质细胞于培养第5天开始出现，2周时已明显增多, 3周时细胞彼此相接，几乎完全融合。

　　1.2　TNFα活性：AL骨髓基质细胞TNFα活性(40.71±6.41)明显高于对照组(6.40±0.58)(P＜0.05)。且将培养上清液稀释至100倍时仍可测出TNFα的活性(表1)。

表1　不同浓度基质细胞培养上清中TNFα活性（±s）

　　*与对照组比较，P＜0.052　骨髓白血病细胞自分泌情况　AL 20例骨髓白血病细胞培养上清液中， 有4例测出TNFα活性，其中3例为M₅，1例为M₄，活性值为38.12％±0.33％。

　　3　血清TNFα活性　AL患者血清TNFα活性值为71.03％±11.14％，显著高于对照组（P＜0.001，表2）。血清、骨髓白血病细胞及骨髓基质细胞TNFα活性水平，以血清活性为最高， 基质细胞与白血病TNFα活性值相近(表2)。

表2　血清、白血病细胞及基质细胞上清TNFα活性（±s）

　　与对照组比较，*P＜0.001；＃P＜0.05

讨 论

　　TNFα对肿瘤细胞的毒性作用已被肯定，但近年来的研究表明，TNFα也能促进白血病细胞的增殖，同时具有抑制正常造血的作用。有研究表明急性白血病细胞对不同浓度TNFα具有不同感受性，高亲和力浓度能引起白血病细胞分化， 而低亲和力浓度抑制其分化。

　　有关体内TNFα分泌活性的研究显示AML、ALL患者血清中TNFα活性明显升高^［5，6］。我们在研究中也观察到AL患者血清中TNFα活性显著升高。Oster等^［7］发现部分新鲜的AML细胞内含有TNFmRNA，并在其培养上清中测出TNFα活性， 证实AML细胞可自分泌TNFα。Zhou等^［8］也证实部分ALL细胞可自分泌TNFα， 并认为TNFα可能是白血病细胞增殖的启动因子。

　　血清TNFα活性测定均在无刺激、无感染条件下进行。其升高不仅见于AL，也见于恶性组织细胞病、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病等多种恶性血液系统疾病。血清中TNF α可能并不象激素那样由某一特定器官产生经血液运送到作用部位，因此血清中TNFα升高是恶性肿瘤患者的共有表现还是AL特有表现尚不明确， 其对AL细胞增殖作用尚待探讨。

　　AL细胞的增殖可能存在自分泌与旁分泌两种机制。 白血病细胞自发性分泌TNFα可能在自身增殖上起一定作用，但并不是所有白血病细胞均能分泌TNFα， 因此了解基质细胞分泌情况很有必要。Mayani等^［2］在研究AML造血微环境及功能完整性时，发现骨髓基质细胞形成能力较差，而且培养上清中存在TNFα等抑制因子， 对基质细胞形成起到抑制作用。我们在培养时添加IL-3及MP 以促进基质细胞及脂肪细胞的生长，培养中观察到AL骨髓基质细胞形成能力仍较正常对照差，但在无刺激条件下TNFα活性却明显高于正常对照组，这表明AL细胞存在TNFα的分泌异常。骨髓基质细胞分泌低浓度的TNFα活性， 对白血病细胞的增殖可能起到重要作用。但这种TNFα活性是出现在急性白血病状态之前还是之后，及其对增殖的确切影响还有待进一步研究。而且在本研究过程中有5例患者（ANLL 4例，ALL 1例）无基质细胞形成，其中4例为高白细胞性白血病， 其难以形成的原因也有待今后进一步探讨。

参 考 文 献

　　1　侯丽君，远藤一靖，金田京子，等.骨髓基质细胞株SC2-4和SC2-5培养上清对各种干细胞集落形成作用的探讨.中华血液学杂志，1994，15：641-642.

　　2　Mayani H，Larry J，Steven C ， et al. Composition and functional integrity of the in vitro hemopoietic microenvironment in acute myelogenous leukemia:effect of macrophage colony-stimulating factor. Exp Hematol ，1992，20：1077-1084.

　　3　Joel S. Is the marrow stroma of AML patients a “Leukemic ” Stroma? Exp Hematol，1992，20：1041-1042.

　　4　Whitolck CA，Witee ON. Long-term culture of B lymphocytes and their precursors from murine bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA ，1982，79：3608-3612.

　　5　Cimino G，Amadori S，Cava MC，et al. Serum IL-2 receptor and TNFα levels are significantly increased in acute leukemia patients. Leukemia，1991，5：32-35.

　　6　Beksa CM，Erturk S，Akan H，et al.The Clinical correlations of serum tumor necrosis factor-alpha in acute leukemia:a predictor of response and relapse? Leukemia，1993，7：1773-1776.

　　7　Oster W，Nicola A，Helga C，et al. Participation of the cytokin IL-6， TNFα and IL-1 beta secreted by AML blasts in autocrine and paracrine leukemia growth control. J Clin Invest ，1989，84：451-457.

　　8　Zhou MX， Harry W， lanhua M， et al. Effect of TNFα on the proliferation of leukemic cells from children with B-cell precursor-acute lymphoblastic leukemia(BCP-ALL)：studies of primary leukemic cells and BCP-ALL cell lines. Blood，1991，77：2002-2007.

(收稿：1997-07-02　　修回：1997-11-28)

(校对：王汝瑞)