PML-RARα反义核酸对早幼粒细胞白血病细胞生长分化的影响
中华血液学杂志 1998年第5期第19卷 论 著
作者：于文强 孙秉中 陈竺
关键词： 反义核酸；融合基因，PML-RARα；白血病，早幼粒细胞性
摘要 目的：研究PML-RARα融合基因的表达对NB4细胞生长分化作用的影响，探讨PML-RARα融合基因与急性早幼粒细胞白血病(APL)发病间的关系。方法：用反义核酸来封闭PML-RARα融合基因的表达并用RT-PCR的方法检测。NB4细胞的生长、分化及功能通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及NBT还原试验加以判定，细胞周期应用流式细胞仪进行分析。结果：反义硫代寡核苷酸(ASODN)通过封闭PML-RARα融合基因的表达能够降低S期细胞的百分率(56%降至37%)，继而抑制NB4细胞生长，促进NB4细胞的分化，提高其NBT还原率。结论：APL特征性的染色体易位t(15;17)形成的PML-RARα融合基因，与APL的发病有关。
Effect of antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) to PML-RARα fusion gene on acute promyelocytic leukemia cell line NB4 Yu Wenqiang,Sun Bingzhong, Chen Zhu.Department of Hematology, Xijing hospital, Xian 710032
Objective: To study the effect of PML-RARα expression on the proliferation and differentiation of NB4 cells, and explore the role of PML-RARα fusion gene in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia (APL).Methods:ASODN-mediated inactivation of PML-RARα mRNA was measured by RT-PCR. The proliferation and differentiation of NB4 cells were determined by proliferation curve, morphology, membrane CD antigen and NBT test. NB4 cell cycle was analyzed by FACS.Results: The inactivation of PML-RARα mRNA by ASODN decreased the percentage of S phase cells (from 56% to 37%), inhibited the NB4 cell proliferation and induced NB4 cells to differentiate to morphologically and functionally mature granulocytes.Conclusion: PML-RARα gene, as a molecular marker of APL, is possibly responsible for genesis of APL.
Key words Antisense oligodeoxynucleotide Fusion gene, PML-RARα Leukemia, promyelocytic
急性早幼粒细胞白血病(APL)特征性的染色体易位t(15;17)形成的PML-RARα融合基因几乎存在于所有的APL细胞中，与APL的发病密切相关。如果能够有效地抑制或封闭PML-RARα基因的表达，就有可能影响APL细胞的生长分化。我们采用针对PML-RARα基因融合点的反义硫代寡核苷酸(ASODN)作用于带有特征性染色体t(15;17)的NB4细胞株，以观察对其生长分化的影响。
材料和方法
1 反义核酸 互补于PML-RARα基因(长型)融合点的全硫代修饰的18聚反义寡核苷酸片段及无义全硫代修饰的寡核酸片段NODN，序列分别为5′-TCTCAATGGCTGCCTCCC-3′和5′-CTGACAACGCAC-ATCTG-3′，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成、纯化、分装，-20℃保存待用。NB4细胞株(急性早幼粒细胞白血病)为上海第二医科大学血液学研究所提供。HL-60细胞由本校免疫教研室提供。
2 细胞培养 NB4细胞和HL-60细胞采用含5%胎牛血清(60℃灭活1小时)的RPMI 1640液体培养，置37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养，实验选用对数生长期细胞。每孔接种量为2ml，细胞浓度为5×104/ml。分别加入终浓度为5，10，20，40，60μmol/L的ASODN，NODN终浓度为60μmol/L,空白对照加入相同量的培养液，每一种处理设4个复孔。培养18小时后再加入初始剂量一半的ASODN和NODN及空白培养液。每天从4个复孔中各取200μl进行细胞计数，取其平均数，台盼蓝拒染法判断细胞活性，绘制细胞生长曲线，计算细胞生长抑制率。NB4细胞为实验组，HL-60细胞为对照组。
3 细胞生长状况检测 细胞活性检测采用台盼蓝拒染法，根据细胞计数描绘生长曲线，计算生长抑制率。
4 细胞分化状况检测
4.1 细胞形态学检测：104～105细胞在离心涂片仪上涂片，自然晾干，瑞氏一步法染色后光镜下进行细胞形态学观察。
4.2 细胞表面标志检测：CD11b和CD33抗原检测采用间接免疫荧光法，在荧光显微镜下观察，然后进行流式细胞仪检测。
5 细胞功能检测 采用NBT还原试验。NB4细胞和HL-60细胞用不同浓度的寡核苷酸处理，培养48小时和96小时后进行NBT还原反应。方法参照文献［1］。
6 细胞周期动力学检测 NB4细胞用不同浓度的寡核苷酸处理，培养96小时后，以正常人淋巴细胞的二倍体染色体作内对照，在流式细胞仪上进行细胞周期动力学分析。
7 PML-RARα基因表达情况检测 采用RT-PCR方法。具体操作参照文献［2］。
结果
1 NB4细胞和HL-60细胞的低血清驯化 为减少血清因素对ASODN作用的影响，我们对NB4细胞和HL-60细胞进行低血清驯化培养，NB4细胞的血清浓度由10%经7%，5%降至2%仍能很好地生长，倍增时间基本不变，血清浓度降到1%时，细胞生长明显抑制。HL-60细胞的血清浓度由10%经7%降到5%时，细胞生长良好，降到3%时，细胞生长抑制。为保证实验条件的一致性，我们确定实验中NB4细胞和HL-60细胞的血清浓度为5%。
2 ASODN对NB4细胞和HL-60细胞增殖的影响 当ASODN浓度大于20μmol/L时，NB4细胞出现生长抑制作用，随着ASODN浓度的增加及时间的延长，NB4细胞的生长抑制作用增强；NODN处理组和空白对照组的NB4细胞生长不受影响(图1)。三种处理方法对HL-60细胞的生长没有影响。
图1 ASODN对NB4细胞增殖能力的影响
3 ASODN对NB4细胞和HL-60细胞分化的影响 ASODN(40μmol/L)对NB4细胞形态的影响主要表现为倒置显微镜下细胞大小不等，胞浆内颗粒增多。W-G染色可见细胞体积增大，核浆比例增高，胞浆颜色变浅，嗜天青颗粒减少，ASODN作用72小时后更为明显，可出现杆状核或肾型核细胞。用NODN处理和空白对照的NB4细胞形态学没有明显变化。细胞表面CD11b、CD33抗原采用流式细胞仪检测，正常NB4细胞CD11b阳性率为0.5%，CD33阳性率为70.4%，ASODN处理48小时后CD11b阳性率升至2.4%，CD33阳性率降为33.8%，96小时后，CD11b阳性率升至15.8%，CD33阳性率降为15.9%。其它处理组NB4细胞及各处理组的HL-60细胞表面标志无明显变化。
4 ASODN对NB4细胞和HL-60细胞功能的影响 采用NBT还原试验以检测NB4细胞和HL-60细胞功能。ASODN(40μmol/L)作用48小时和96小时后NB4细胞的NBT还原能力明显提高，而对HL-60细胞没有影响(图2)。
5 ASODN对NB4细胞周期的影响 细胞周期分析表明ASODN能够明显降低S期细胞的百分率，当浓度为40μmol/L、作用96小时时空白对照组S期细胞为56%，NODN处理组为53%，ASODN处理组为37%。
图2 ASODN对NB4细胞NBT反应的影响
6 ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的影响 在体外采用异硫氰酸胍一步法提取不同处理组NB4细胞的RNA进行RT-PCR，其产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，发现ASODN作用8小时后，PML-RARα基因表达降低，表现为PML-RARα基因特异性扩增带荧光亮度变浅，48小时后特异性扩增带消失，此作用可持续至96小时。
1：0小时；2：8小时；3：48小时；4：96小时；
5：阴性对照；6：阳性对照
图3 ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的影响
讨论
PML-RARα基因是APL细胞的特异性标志，与APL的发病密切相关。反义技术作为基因“封条”能够特异地封闭或抑制其靶基因的表达，互补于靶基因不同位置的反义核酸其特异性和作用效率不同。要用反义核酸特异性地封闭一个融合基因，必须在其融合点附近设计反义核酸，从而才有可能避免反义核酸对细胞中的野生型基因造成影响。我们设计了一个互补于PML-RARα基因(L型)融合点上、下游各9个核苷酸的18mer反义寡核苷酸，计算机分析该序列与人类其它基因没有同源性。通过对ASODN进行硫代修饰，采用60℃、1小时灭活血清，同时降低培养细胞的血清浓度［3］等方法提高了ASODN的作用效率。实验结果表明ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的抑制具有特异性。
肿瘤的发生必须具备两个条件：一是细胞增殖旺盛或出现凋亡抑制，二是细胞出现分化障碍。在APL细胞中，PML基因能够调控细胞的生长，而RARα能够促进细胞的分化，PML-RARα的形成显然抑制了其野生型PML和RARα的功能［4］，这就具备上述两个条件，导致了APL的发生。ASODN能够抑制PML-RARα基因的表达，必然能够抑制NB4细胞的生长。在实验中，我们发现20μmol/L的ASODN就能够抑制NB4细胞的生长，随着 ASODN剂量的增大和时间的延长，抑制作用增强，表现为很强的剂量时间依赖性。细胞周期分析发现ASODN可能是通过降低S期细胞百分率来抑制NB4细胞的生长。PML-RARα基因不仅与细胞的恶性增殖有关，而且与细胞的分化障碍有关。它改变了RARα的转录活化功能，竞争性地与维甲类受体(RXR)形成异源二聚体，显性灭活RARα及甲状腺素受体、维生素D3受体等核内受体，阻断了骨髓干细胞的正常分化。将PML-RARα基因导入HL-60及U937细胞，能够纯化维甲酸(RA)并阻断维生素D3对他们的诱导分化［5］。如果能够抑制PML-RARα的表达，有可能促进NB4细胞的分化。我们用ASODN封闭了PML-RARα基因后，发现NB4细胞出现了部分分化，表现为细胞体积增大，核浆比例增高，NBT还原能力有所增强，但细胞分化并不完全，表现为在培养瓶中贴壁现象不明显，核仁未见明显减少，与维甲酸诱导分化相比，NBT还原能力增幅不大。在另外的实验中，我们发现ASODN能够提高NB4细胞对维甲酸的敏感性，表明ASODN对NB4细胞的诱导分化作用有赖于维甲酸的存在。原因可能是ASODN不能完全阻断PML-RARα基因的表达，另一方面PML-RARα基因的表达并不是APL发病的唯一因素，而且NB4细胞除了t(15;17)易位以外，还有其它染色体异常［6］，抑制其中某一个基因的表达，并不能使它彻底“改邪归正”。
参 考 文 献
1 Richard P, Werner B. Potentiation of retinoid-induced differentiation of HL-60 and U937 cell lines by cytokines. Eur J Cancer, 1991, 27:53-58.
2 陈赛娟，蔡敬仁，李秀松，等. 用逆转录酶/多聚酶链式反应检测早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因. 中华血液学杂志， 1993， 14：3-5.
3 Eliel B, Patrick I. Oligonucleiotides in the treatment of leukemia. Hematol Oncol, 1994, 12:9-14.
4 Francesco G, Marta F, Myriam A, et al. Acute promyelocytic leukemia: from genetics to treatment. Blood, 1994, 83:10-25.
5 Philippe R, Bhushan H, Atusha P, et al. The PML-RARα gene product of the t(15;17) translocation inhibits retinoic acid-induced granulocytic differentiation and mediated transactivation in human myeloid cells. Oncogene, 1994, 9:545-551.
6 Lanotte M, Martin V, Najman S, et al. NB4, a maturation inducible cell line with t(15;17) marker isolated from a human acute promyelocytic leukemia (M3）. Blood, 1991, 77:1080-1086.
(收稿：1996-12-02 修回：1997-10-27)
(校对：徐丽娟)
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