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IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略

IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略

中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 第七届肿瘤和第八届免疫专业委员会学术会议论文摘要

作者:崔建舞 奚永志 郑黎燕 刘爽 刘楠 屠敏 郭斯启 陈兴国 金荔 孔繁华

单位:军事医学科学院附属医院免疫学研究室 国家生物医学分析中心免疫学研究室,北京 100039

  目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略。鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨。方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等。将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定。IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测。2. 应用核酸及蛋白质序列软件GOLDKEY系统计算机模拟分析IL6-Linker-PE40及IL6-PE40的柔性、抗原性、亲水性及表位等分子生物学特性。3.表达IL6R的大鼠急性早幼粒白血病细胞模型建立:采用电转法将线形化的质粒IL6R cDNA导入BNML模型LI12细胞,用G418筛选NeoR克隆并扩增。4. IL6R基因在LT12表达的鉴定:FACS检测IL6R表达;[125I]-IL6受体结合实验测定IL12-IL6R细胞的IL6R数和新合力;Northern-Blot鉴定IL6R基因在LT12-IL6R+细胞上的整合与表达。5.IL6R基因的整合对LT12-IL6R细胞模型生物学特征的影响;6.IL6-PE40对白血病及正常造血细胞的体外作用:CFU-L、CFU-GM及[3H]-TdR掺入:检测不同浓度的IL6-PE40和rhIL6对LT12、LT12-IL6R及正常骨髓细胞DNA合成的影响。7. IL6-PE40对表达IL6R的白血病及正常大鼠的体内效应。结果:1. 利用SOE术将已克隆的IL6 cDNA与PE40 DNA片段融合构建成为IL6-PE40,并在两端引入酶切位点克隆至pBV220表达质粒后,筛选得到两种不同的重组表达质粒pIE01的和pIE02,双酶切及测序证实所预期约1500 bp DNA片段的存在,pIE01为在IL6和PE40间有一接头,而pIE02则是两基因的直接相连。2.将含重组质粒接种于LB中诱导表达,激光仪扫描测得pIE01表达水平为52.2%,pIE02的表达水平为39.0%,Western-blot证明表达产物与IL6及PEA抗体发生特异性反应,SDS-PAGE显示其分子量约60 kD的蛋白。经HPLC及凝胶层析获得>98%纯度的IL6-PE40,细胞毒活性鉴定证实IL6-PE40能高度特异地抑制U266细胞的蛋白质合成。3. IL6-Linker-PE40和IL6-PE40分别保留了IL6和PE40的表位特征;柔性接头对等电点没有任何影响,二者的等电点均为5.15;并且融合蛋白没有产生新的抗原表位,IL6-Linker-PE40柔性接头处的抗原性极低;Western-blot显示这两个融合蛋白分别能与IL6和PEA的单抗发生特异性结合,证明它们较好地保留了IL6和PE40的空间结构。4. 在含G418的液体培养基中,筛选出17个含有稳定整合该IL6R cDNA的集落,称之为LT12-IL6R。将其在含G418的液体培养基中持续传代达6个月,并经尾静脉注入正常BN大鼠体内传代,FACS检测IL6R的表达显示,LT12-IL6R与MT18单抗结合后呈明显的荧光信号。受体结合实验表明,LT12-IL6R与[125I]-IL6具有很高的结合力,Scatchard作图Kd=4.7 nM,每个细胞IL6R数为4 000~5 000。Northone-blot显示,LT12-LT6R的RNA与[32P]-IL6R cDNA探针呈显著的杂交信号。并且IL6R cDNA在IL12中的稳定整合与表达并未改变IL12原有的生物学特征,尤其是白血病源性。5. IL6-PE40 1~1 000 ng/mL呈剂量依赖性抑制LI12-IL6的CFU-L形成及DNA合成,相反,对IL12的CFU-L无明显抑制作用。而IL6对两种细胞的CFU-L形成及DNA合成均无任何影响。6. IL6-PE40在1~1 000 ng/mL对正常骨髓细胞的CFU-GM及DNA合成无明显抑制作用。而IL6则呈剂量依赖性刺激CFU-GM形成。7. 在接种LI12-IL6的第3 d(早期),采用皮下埋藏微量渗透泵连续7 d应用IL6-PE40 275 μg/kg·d-1可减少90%的白血病负荷,使白血病鼠的生存期明显延长达2 d,而在第10 d(发病晚期)后连续应用7 d IL6-PE40亦获相同疗效。相反,该剂量方案对正常BN大鼠的骨髓CFU-GM、CFU-S8、CFU-S12及具有骨髓重建能力的MRACFU-GM无抑制效应。结论:采用基因融合新策略构建成功了IL6-PE40并获高效表达。通过转基因术成功地建立了高表达IL6R的BNML大鼠急性早幼粒白血病细胞的体内外模型LT12-IL6R。应用该模型,证明IL6-PE40不但能特异性地杀伤体外高表达IL6R的大鼠白血病细胞,而且还明显延长白血病大鼠的生长期。相反,IL6-PE40对体内外正常造血细胞无明显的毒副作用。这无论对于体内直接应用还是体外用于自体BMT前清除白血病细胞均极为有益。从而证实利用IL6/IL6R系统介导靶向杀伤白血病细胞这一新策略的科学性、特异性和可行性,为IL6-PE40应用于临床导向治疗白血病奠定了坚实的基础。

  国家自然科学基金(No.39500062和No.39500098);中荷科技交流基金资助项目


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