细胞因子-受体介导靶向杀伤白血病细胞的新策略

刘爽　奚永志

　　关键词：肿瘤导向杀伤 iL-2/IL-2R IL-6/IL-6R

　　GM-CSF/GM-CSFR利用细胞因子-受体介导重组细胞因子-外毒素蛋白来选择性杀伤白血病细胞标志着肿瘤导向杀伤策略研究的最新进展之一，它屏弃并弥补了以抗原-抗体为主体的第一代导向杀伤策略的诸多不足或缺陷^［1，2］。近年来美国科学家开拓性地构建成功了数种以绿脓杆菌(PE)和白喉杆菌(DT)外毒素为主体的重组细胞因子-毒素蛋白，证明它们能在体内外高度特异性地杀伤高表达相应细胞因子受体的肿瘤细胞，而对正常组织或细胞无明显的毒性。随后，美国食品与药品管理委员会(FDA)迅速批准了重组细胞因子-毒素蛋白的I/II期临床应用研究，用于治疗晚期经放、化疗无效的慢性淋巴细胞白血病(CLL)、霍奇金病(HD)及淋巴瘤(NHL)等取得显著疗效，未见明显毒副作用，为 iII期临床应用研究奠定了坚实的基础^［3］。此疗法的探索以其思路的新颖性、科学性和实践的可行性，为白血病治疗开辟了又一新途径。

　　一、白细胞介素-2/白细胞介素-2受体(IL-2/IL-2R)系统介导的杀伤

　　现已证明，许多血液系统恶性肿瘤细胞表达高亲和力IL-2R，如成人T细胞白血病(ATL)、毛细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病急淋变、HD与NHL、蕈样肉芽肿(MF)及Sezary综合征(SS)等。相比而言，IL-2R更主要地表达于T细胞源性白血病或淋巴瘤，如可同时高表达IL-2R的三个亚单位，B细胞源性次之，而粒细胞源性白血病几乎不表达IL-2R的α-β链^［3，4］。

　　HUT-102是ATL细胞系，仅IL-2R α链的数量就高达(1.5～6.0)×10⁵/细胞，对抗-Tac(FV)-PE40KDEL(PE40突变体)、抗-Tac(FV)-PE40、DT388-IL-2、DT388-抗-Tac(FV)十分敏感。根据IL-2Rα-β-γ链表达的不同以及对DAB389-IL-2杀伤敏感性的关系，已得出如下结论：(1)γ链单独不能结合DAB389-IL-2，但可介导IL-2R/DAB389-IL-2复合物的内化，是产生杀伤效应所必需，并需β链的共表达；(2)在已有γ链表达的前提下，β链对于产生任何程度杀伤效应是必需的，β链能赋予表达β-γ链的靶细胞对DAB389-IL-2中度的亲和力；(3)只有同时表达α-β-γ链方可形成高亲和力受体，产生最大的杀伤效应。因此，仅检测α链的表达是很难预测靶细胞对IL-2毒素蛋白的敏感性，最有价值的是要同时检测α-β-γ三链的表达^［4］。

　　上述四种毒素蛋白对ATL病人的新鲜细胞亦产生较强的杀伤效应，IC₅₀为0.0016～0.016 0 μg/L。在一组Tac抗原表达＞70%～95%的大多数ATL初诊病人中，其细胞对上述四种毒素蛋白的抑制反应却有所不同，抗-Tac(FV)-PE40KDEL＞抗-Tac(FV)-PE40＞DT388-抗-Tac(FV)＞DT388-IL-2，抗-Tac(FV)-PE40KDEL的杀伤效应分别是后三者的3、10和100倍。由于 aTL细胞在人体内呈活跃增殖状态，治疗时这些毒素蛋白会在体内迅速产生杀伤效应^［5］。

　　由此可见，无论是ATL的细胞系抑或新鲜细胞，PE为主体的毒素蛋白的杀伤效应要大于DT。原因在于：(1) 前者与IL-2R的亲和力要高于后者3倍；(2) 抗-Tac(FV)配基的氨基末端是游离的，可更好地与IL-2R结合； (3)杀伤活性区与抗-Tac (FV)功能区结合部位的相互作用在 DT388要大于PE40，它会干扰配基与IL-2R的结合。并且，同一类毒素蛋白杀伤活性的不同（如PE40和PE40KDEL）却与IL-2R亲和力无关，而是PE c末端第602位氨基酸REDLK位点被突变为KDEL(内质网潴留信号)的缘故。除此之外，ATL细胞对以抗-Tac(FV)和以IL-2为基础的毒素蛋白的杀伤敏感性也是不同的，这主要是ATL细胞所表达IL-2R的亲和力及P75/P55的比值不同所致^［3，5］。

　　1996年Frankel等^［6］另辟新境，首次研制成以蓖麻毒素(ricin)为主体的重组细胞因子-毒素蛋白ADP-IL-2-ADP-RTB［W37S/Y248H］-RTA，随后，又研制了ADP-IL-2-ADP-RTB［W37S/Y248H/Y78H］-RTA，它与高、中、低亲和力的IL-2R均能结合，对表达部分IL-2R细胞的杀伤力与IL-2-PE40相同，但与DAB389-IL-2明显不同。该研究最大的贡献在于，彻底突破了以往对ricin研究的障碍，即无论是用基因工程抑或化学偶联法删除ricin中的半乳糖结合位点后，均使ricin丧失了细胞内杀伤活性。应指出的是，ricin毒素与细菌毒素无免疫交叉反应，病人体内也不含天然的抗ricin抗体，尤其当病人对PE或DT类毒素蛋白产生抗性时，以ricin为主体的毒素蛋白就显得更为重要，相互之间可起到互补，甚或可联合应用^［7］。

　　由于正常造血干细胞不表达任何IL-2R，＞90%的CD⁺₃₄造血细胞也不表达P55或Tac抗原，所以至少可以肯定造血干/祖细胞对这些毒素蛋白是不敏感的。而且无论是抗-Tac(FV)-PE40、抗-Tac(FV)-PE40KDEL还是DT388-抗-Tac(FV)及DT388-IL-2对人正常外周血单个核及骨髓细胞均未发现细胞毒作用，即使当浓度＞10μg/L时亦是如此。动物体内的初步结果也表明，抗-Tac(FV)-PE40和抗-Tac(FV)-PE40KDEL在猴子血清浓度即使高达0.4μg/L时，并未产生血液系统的毒副反应^［3，5］。

　　体外实验的巨大成功极大地促进了重组细胞因子-毒素蛋白的临床应用,1991年FDA迅速批准了DAB486(DT突变体)-IL-2的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，治疗高表达IL-2R的晚期耐药的难治性血液系统恶性肿瘤，包括CLL、CTCL、NHL、HD以及MF/SS患者，获得显著疗效。这也是国际上第一个被获准进行临床应用的重组细胞因子-毒素蛋白。随后又批准了DAB389-IL-2，它比DAB486-IL-2短97个氨基酸，半寿期更长、药动学更好，杀伤效力大于DAB486-IL-2的10倍之多。虽然从Ⅰ/Ⅱ期的剂量递增实验中还难以完全确定这些毒素蛋白的抗肿瘤效应，但的确观察到约12%～50%的耐药难治性的病人获得令人信服的客观性反应。这些显著的临床疗效，加速了几个Ⅱ期和一个Ⅲ期研究方案的获准（目前正在进行的Ⅲ期临床是用DAB389-IL-2治疗CTCL），以最终明确两种毒素蛋白的真正疗效^{［3，8，9］}。值得重视的是，美国Seragen公司有两个研究小组还同时在进行DAB389-IL-2治疗严重斑块型牛皮癣和爱滋病的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，亦取得十分鼓舞人心的结果^［1］。

　　二、白细胞介素-6/白细胞介素-6受体(IL-6/IL-6R)系统介导的杀伤

　　IL-6是白血病细胞的自泌与旁泌因子，几乎所有的粒、单白血病细胞系均高表达IL-6R。用定量反转录-聚合酶链反应对39例急性粒细胞白血病(AML)、32例ALL和7例AMLL进行IL-6、IL-6Rα及β链基因表达的检测发现，无论是否表达和分泌IL-6，所有的AML、AMLL和50% aLL病人的细胞均高表达IL-6R，且IL-6R α与β链的表达在AML和AMLL中呈明显的相关性^［10］。

　　IL-6/IL-6R是国际上最先用来探索细胞因子-受体导向杀伤白血病的系统。奚永志^［11］采用LT12-IL6R⁺急性早幼粒细胞白血病模型表明，IL-6-PE40对LT12-IL6R⁺细胞的集落形成单位(CFU-L)和DNA合成呈剂量依赖性抑制，IC₅₀仅为0.0013μg/L，相反对LT12-IL6R^-细胞的CFU-L并无抑制。而人AML对IL-6-PE40的杀伤敏感性IC₅₀最低为0.07μg/L，IL-6R表达量低者，敏感性差，不表达者则完全无反应。但是研究还发现，在同一种肿瘤细胞中，IL-6-PE40的抑制效应与IL-6R的数量呈正比，而在不同的肿瘤细胞中，其杀伤效应似乎与IL-6R数无关^{［11，12］}。应指出的是，细胞因子-毒素蛋白的杀伤效应除了与相应受体数目有关外，还与受体-毒素蛋白的内化速度、转运入胞浆的效率以及分解成活性成分的速度等因素有关^［11］。

　　正常棕色挪威(BN)大鼠尾静脉注射5×10⁵ LT12-IL-6R⁺后100%的发展成为棕色挪威急性髓细胞白血病模型(BNML)，在接种后的第3天（急性期），采用皮下埋藏Alzet微量渗透泵连续7天应用IL-6-PE40，275μg*kg^-1*d^-1可导致90%的白血病负荷减少，使BNML白血病鼠的生存期明显延长，而在接种后的第10天（发病晚期）连续应用IL-6-PE4E亦获相同疗效。说明IL6-PE40的体内抗白血病效应与体内白血病细胞的负荷量无关^［12］。

　　由于正常状态下人外周血粒单细胞、骨髓粒-单前体细胞及CD⁺₃₄造血细胞也表达低量或微量IL-6R，所以弄清IL-6-PE40或DAB486-IL-6等毒素蛋白对正常造血细胞的毒性是至关重要的。我们的结果表明，IL-6-PE40对正常BN大鼠的骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及DNA合成无任何抑制^［11］；IL-6-PE4E对正常人骨髓细胞的蛋白质合成、CFU-GM和红系暴式集落形成单位(BFU-E)也无抑制；骨髓细胞与高浓度IL-6-PE4E体外孵育40小时，细胞活力仍维持在75%～95%，表明正常骨髓细胞的增殖并不受大剂量IL-6-PE4E的影响。另一项研究的结果也显示，DAB389-IL-6在高浓度时对人的CFU-GM、BFU-E及混合系集落形成单位(CFU-Mix)亦无任何抑制。将U266骨髓瘤细胞和正常骨髓细胞混合作祖细胞培养，DAB389-IL-6能有效地抑制U266细胞的集落形成，但对各种造血祖细胞无抑制作用。给正常BN大鼠275 μg*kg^-1*d^-1应用7天IL-6-PE4E也并未对外周血白细胞、骨髓CFU-GM、CFU-S_8、12及具骨髓重建能力的CFU-GM产生抑制；相反IL-6-PE4E却使中性粒细胞、血小板和网织红细胞计数增加，当治疗停止后血小板恢复正常，而红细胞却有所下降，天冬氨酸转移酶轻度升高，提示肝功能有轻度损害^［12］。说明IL-6R在这些早、晚期造血细胞中的表达量甚低乃至不表达。由此可见，IL-6-PE40和DAB-IL-6不仅不会产生临床难以接受的毒副作用，而且还具有很强的特异性抗白血病效应，将成为非常有希望的新型抗白血病生物制剂。新近我们采用基因融合新策略率先在国内外构建成功杀伤活性更高的IL-6-PE40。

　　三、粒-巨噬细胞集落刺激因子/粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSF/GM-CSFR)系统介导的杀伤

　　GM-CSF是维持AML自主性生长最主要的自泌和旁泌因子，约85%的AML表达GM-CSFR，绝大多数AML仅表达高亲和力GM-CSFR。相对而言，GM-CSFR在M₄及M₅型的表达要高于M₁和M₂型。虽然GM-CSFR和IL-3R可共表达于AML，但GM-CSFR的表达量要高于IL-3R10倍。

　　最先利用GM-CSF/GM-CSFR系统进行导向杀伤的毒素蛋白是化学偶联的GM-CSF-SAP(皂草素)，它能显著抑制经转染并共表达α和β链GM-CSFR的白血病细胞。1995年Chan等^［13］首次构建成功重组DT390-mGM-CSF，并证明该毒素蛋白成剂量依赖性抑制GM-CSF依赖株鼠粒-单白血病细胞FDCP2.1的DNA合成。1997年Kreitman和Pastan及Bendel等^{［14，15］}又分别构建成功了重组人GM-CSF-PE38KDEL、DT388-GM-CSF及DT_CT-GM-CSF。三种毒素蛋白对各种GM-CSFR⁺白血病细胞系的杀伤效应有所不同，如GM-CSF-PE38KDEL对U937的IC₅₀为0.095μg/L、HL60为100 μg/L、DT388-GM-CSF则为0.02～0.04 μg/L、而DTCT-GM-CSF对红白血病(TF-1)、HL-60、单核细胞白血病(THP-1)及杂合型白血病(MV4-11)分别为1.0～40μg/L，但对GM-CSFR^-的白血病细胞系均无杀伤，表明了GM-CSF毒素蛋白的杀伤特异性^［14-16］。

　　最令人振奋的是，DTCT-GM-CSF对耐药白血病细胞株，如高表达GM-CSFR且同时表达多药耐药相关蛋白(MDR)表型的阿霉素耐药株(HL60/ADR)以及同时高表达P-糖蛋白相关MDR表型的长春新碱耐药株(HL60/VCR)，亦显示出高杀伤活性。此外，对p53缺乏的HL60以及高表达bc1-2且对放疗抗性的杂合型白血病RS4;11也产生特异杀伤，对其白血病细胞集落形成单位(CFU-AML)的抑制率达96.0%～99.5%。而对p53缺乏AML病人CFU-AML的抑制率亦高达92.0%～99.9%，并且可使AML的早、晚期白血病鹅卵石区形成细胞(L-CAFC)减少2个log^［16］。由此可见，GM-CSF毒素蛋白不仅能有效杀灭新鲜白血病细胞及CFU-AML克隆源性祖细胞，而且对已产生耐药的难治性、放疗抗性且高表达多药耐药蛋白或基因等因素的白血病细胞也产生高效杀伤。

　　新近的体内实验显示，50 μg*kg^-1*d^-1连续皮下注射7天DT-GM-CSF可使BNML白血病大鼠骨髓中的LT12白血病细胞减少1～2个log。采用人白血病-重症联合免疫缺陷鼠模型(AML/SCID)检测7例AML的结果表明，SCID鼠在接种人AML细胞后的第3～10天按75μg*kg^-1*d^-1连续注射DT-GM-CSF，在第40天有4例AML/SCID鼠骨髓内的白血病细胞消失，1例减少；另2例与对照组相同，而这2例AML的细胞在体外实验中就对DT-GM-CSF不敏感^［17］。

　　GM-CSF毒素蛋白会否也对正常造血干/祖细胞产生严重的损伤，这是必须阐明的关键问题。已有的结果表明，DT390-mGM-CSF在1～10 nmol/L时仅对正常鼠骨髓CFU-GM产生一定的抑制，但对外周血淋巴细胞、BFU-E、CFU-Mix、2周的CAFC及长期重建细胞无任何影响^［13］。不过新近荷兰学者的研究却显示，DT-GM-CSF与正常人骨髓孵育48小时并未发现对CFU-GM产生任何抑制。体内的研究也表明，DT390-GM-CSF对8及12天CFU-S的抑制甚微。正常BN大鼠皮下注射DT-mGM-CSF7天后也未对CAFC、CFU-S、CFU-GM和BFU-E产生任何抑制，毒性反应仅表现为中度的肝肾损害，对某些大血管可引起内皮细胞发炎，但无破坏性损伤^［17］。似乎可以认为早期造血祖细胞或干细胞并不表达高亲和力GM-CSFR，即使表达，量也甚微，不足以产生毒性反应。因此，可使用更大剂量的GM-CSF毒素蛋白对白血病患者进行治疗。

　　从理论上讲，利用细胞因子-受体介导的第二代导向杀伤较以抗原-抗体为主体的第一代导向杀伤具有如下优势：(1)导向的特异性更强、杀伤力更高；(2)细胞因子与毒素蛋白以肽链相连，稳定性更好；(3)毒素蛋白不含碳水化合物，在血浆中的清除速度减慢，作用时间延长，且对肝肾细胞损伤减轻；(4)可进行工业化大生产，使其结构均一，活性稳定；(5)通过点突变可对编码基因重塑改造，生产出分子量更小、穿透力更强、疗效更好的重组细胞因子-毒素蛋白。这既能增强导向杀伤的特异性，又克服了耐药性的产生，还不会导致继发性肿瘤。

　　本课题受国家自然科学基金及中荷科技交流基金资助(39500062)

　　作者单位：100039北京，军事医学科学院附属医院免疫学研究室

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收稿：1998-05-21　　修回：1998-08-17