紫杉醇诱导人乳腺癌细胞凋亡过程DNA甲基化水平检测
肿瘤 1999年第2期第19卷 论著
作者：陈于法 郑 树 陈丽荣 李士敏
单位：陈于法 郑 树 陈丽荣（浙江医科大学肿瘤研究所(杭州 310009)；李士敏（浙江医科大学分析中心）
关键词：细胞凋亡；紫杉醇；DNA甲基化；乳腺肿瘤；细胞株
目的 紫杉醇诱导细胞凋亡过程中DNA甲基化水平状态及其意义，尚未见报道。 方法 本文应用反相高效液相色谱法和琼脂糖凝胶电泳法对紫杉醇诱导人乳腺癌细胞(BCap37)凋亡过程中DNA甲基化水平进行分析，并与秋水仙碱、顺铂、鬼臼乙叉甙、阿霉素和放线菌酮处理组进行比较。 结果 紫杉醇处理BCap37细胞3小时，DNA甲基化水平降低；在处理12～24和48小时时，DNA甲基化水平逐渐上升，在48小时达到最高峰，显著高于对照组(P＜0.02)。然而在处理72小时，DNA甲基化水平明显降低，并低于对照组(P＜0.05)。除阿霉素处理BCap37细胞能够使DNA甲基化水平降低之外，其余抗癌药处理组细胞DNA甲基化水平均有轻度的增高。 结论 在紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡过程中，细胞DNA甲基化水平增高可能与先前研究发现的腺苷基蛋氨酸合成酶基因表达增高密切相关。本文就DNA高甲基化反应在紫杉醇诱导的细胞凋亡中的潜在生物学意义进行了讨论。
DETECTION OF CELLULAR DNA METHYLATION IN
TAXOL-INDUCED APOPTOSIS OF HUMAN BREAST CANCER CELLS
Chen Yufa1，Zheng Shu1，Chen Lirong1，Li Shimin2.1Cancer Institute,2Analytic Center,Zhejiang Medical University,Hangzhou,310009
Objective：Cellular DNA methylation status and biological functon in the process of taxol-induced apoptosis remains unclear.Methods：Reversed phase high performance liquid chromatography and 1% agarose gel electrophoresis were utilized in the detection of DNA methylation level and DNA fragmentation in taxol-induced apoptosis of human breast cancer cells(BCap37). The DNA methylation level resulted from taxol treatment was compared with that from colchicine,cis-platin,etoposide,doxorubicin and cycloheximide treatments respectively.Results：Taxol treatment at 3 hours resulted in temporary decrease of DNA methylation.Then,the hypermethylation of DNA gradually appeared at 12,24 and 48 hours of taxol treatment.At 48 hours,the DNA methylation reaction reached a peak,which was significantly higher than that of control group(P＜0.02).However,at 72 hours,when apoptotic cell death became evident ,the DNA methylation level was reduced significantly lower than that of the control(P＜0.05).Except for doxorubicin resulting in the decrease of DNA methylation,colchicine,cis-platin,etoposide or cycloheximide treatment slightly increased the DNA methylation level.Conclusion：In the taxol-induced apoptosis the hypermethylation of cellular DNA is closely associated with the up-regulation of S-adenosylmethionine synthetase gene previously identified.The potential biological significance of the hypermethylation of cellular DNA in taxol-induced apoptosis was discussed.
Key words Apoptosis Taxol DNA methylation Breast neoplasms Cell line
紫杉醇是一类新颖的以抗微管解聚为特征的抗肿瘤药物，对肿瘤的杀伤作用与其抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡有关［1，2］。在研究紫杉醇诱导人乳腺癌细胞(BCap37)凋亡表达相关基因中，发现紫杉醇能够诱导乳腺癌细胞腺苷基蛋氨酸合成酶的RNA水平表达增高，且该酶活性亦增高［3］。腺苷基蛋氨酸合成酶是腺苷基蛋氨酸合成途径中的关键酶，而腺苷基蛋氨酸是DNA甲基化反应的最主要的甲基供体［4］。在紫杉醇诱导细胞凋亡中，腺苷基蛋氨酸合成酶基因表达增高和DNA甲基化水平改变之间的相关性，尚未见报道。本文应用反相高效液相色谱方法，对紫杉醇以及不同抗癌药物处理诱导乳腺癌细胞凋亡过程中细胞DNA的甲基水平进行测定，以阐明腺苷基蛋氨酸合成酶基因表达增高与细胞DNA甲基化水平的相互关系。
材料和方法
1.细胞培养和药物处理
人乳腺癌细胞BCap37源自人乳腺浸润性髓样癌，细胞培养条件和紫杉醇处理参照文献［2］进行。紫杉醇购自Calbiotech公司(USA)，分子量为853.9，纯度为97.5%，工作浓度为100 nmol/L。秋水仙碱，放线菌酮，阿霉素，鬼臼乙叉甙均为Sigma公司产品，顺铂为浙江省海门制药厂产品，工作浓度分别为50 nmol/L、5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μmol/L。
2.光镜观察
紫杉醇处理BCap37细胞后，定时在倒置显微镜下观察细胞形态。
3.DNA裂解片段分析
紫杉醇等药物处理BCap37细胞至预定的时间后，胰酶消化收集，按文献［2］所述进行DNA裂解片段分析。
4.基因组DNA提取
紫杉醇等药物处理BCap37细胞至预定的时间后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，加入1.2 ml消化液缓冲液(100 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、25 mmol/L EDTA、0.5% SDS、0.1 g/L蛋白酶K)，50 ℃温育12～18 h，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)重复抽提，加入0.5个体积的7.5 mol/L NH4Ac，再加入2个体积的纯酒精，冰上30 min，离心沉淀，70%酒精洗涤，干燥沉淀物，最后溶于60 μl的TE缓冲液中。DNA浓度由分光光度法测定。
5.DNA消化处理及反相高效液相色谱(HPLC)测定
参照文献［5］方法取10～40 μg的基因组DNA，加入DNase I 15 U、MgCl2 4 mmol/L，反应体积40 μl，37 ℃温育18 h，然后加入2个体积30 mmol/L NaAc,50 μg/L ZnSO4和50 mg/L核苷酶P1，37℃温育7 h。最后加入0.1体积碱性磷酸酶(88 U/ml)(上述均为Sigma产品)，37 ℃继续温育16 h。测定前储于-70 ℃。
反相高效液相色谱检测条件：岛津LC-6A液相仪(日本)；色谱柱：CLC-ODS，Φ 4.5 mm×15 mm，柱温40℃；流动相：5 mmol/L 甲酸铵-10%甲醇，流速：1 ml/min，检测波长280加样量20 μl。以不同浓度纯胞嘧啶(Cytosine,Cyt)及5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5-Cyt)5 ml，标准品作浓度标准曲线，以峰下面积回归得出Cyt和m5-Cyt占总量的克分子百分比。
6.数据处理和分析
不同药物和不同时点均重复3个样本(n=3)，数据以
±s表示，经配对t检验。
结 果
1.光镜观察 BCap37细胞经紫杉醇处理后，随着处理时间延长，细胞出现的主要病理变化为多边形细胞变圆，体积缩小，折光性增强。继而出现破碎的细胞并漂浮在培养液之中。
2.DNA裂解片段分析 BCap37细胞在紫杉醇处理后48 h，开始出现低密度典型的180 bp整数倍的阶梯状条带。DNA条带密度随处理时间增加而增高，72 h的条带比48 h明显增高(图1)。其他药物处理BCap37细胞72 h后，均可检测到明显的阶梯状条带。
图1 1.0%琼脂糖凝胶电泳显示，BCap37细胞经紫杉醇处理3～72 h DNA裂解片段变化
M：1 kb DNA标记物
3.DNA 5-甲基胞嘧啶含量的反相HPLC测定 BCap37细胞m5-Cyt含量占胞嘧啶总量的2.6%。紫杉醇处理BCap37细胞3 h，细胞内m5-Cyt含量降低，比对照组低7%，而在处理12、24、48 h，细胞内m5-Cyt含量持续升高，在48 h达到高峰占3.12%(P＜0.02)。在72 h细胞内m5-Cyt含量急剧降低仅占2.22%，显著低于对照组(P＜0.05)(见图2)。不同浓度紫杉醇处理后，BCap37细胞m5-Cyt含量变化在同一时间无明显的作用差异。
除阿霉素处理BCap37细胞引起DNA m5-Cyt含量降低外，其余药物处理BCap37细胞则增加DNA m5-Cyt含量水平，但是，各处理组与对照组比较，差异均无统计学意义，见附表。
附表 紫杉醇等抗癌药处理BCap37细胞24 h和48 h时DNA中5-甲基胞嘧啶含量变化(%)
| 时间(h) |
样本数 |
对照组 |
紫杉醇 |
秋水仙碱 |
顺铂 |
鬼臼乙叉甙 |
阿霉素 |
放线菌酮 |
| 24 |
3 |
2.60±0.14 |
2.93±0.11 |
2.39±0.07 |
2.84±0.01 |
2.50±0.09 |
2.36±0.08 |
2.79±0.05 |
| 48 |
3 |
2.61±0.11 |
3.12±0.16* |
2.27±0.02 |
2.75±0.10 |
2.75±0.10 |
2.34±0.98 |
2.79±0.11 |
*与对照组比较，t=5.592，P＜0.02
2 反相高效液相色谱检测法结果显示，BCap37细胞经过紫杉醇处理
3～72 h DNA中5-甲基胞嘧啶含量百分比变化
讨 论
5-甲基胞嘧啶和N6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine,N6Mde)是DNA组成碱基中主要的甲基化形式，以前者占主导地位，检测DNA 5－甲基胞嘧啶含量基本上能够反应DNA甲基化水平［6］。DNA甲基化水平的异常在恶性肿瘤是一较为常见的现象，可表现整体甲基化水平低下和局部CpG岛甲基化增高并存。最新的研究结果表明，CpG岛甲基化是造成p53，p16和Rb等抑癌基因突变和基因失活的原因之一，故DNA甲基化异常是肿瘤发生过程中重要的早期事件之一［7］。细胞凋亡调控机制异常是细胞增殖和死亡失衡从而导致肿瘤发生的重要方面之一［8］。细胞DNA甲基化水平变化对细胞凋亡发生发展及其结局所产生的作用，目前尚不十分清楚。Pogribry等研究发现，乏甲基食物诱发的大鼠肝细胞DNA低甲基化水平状态对酶或氧化剂裂解DNA效应更为敏感，DNA裂解程度与DNA低甲基化水平呈正相关。他们认为，DNA甲基化反应可能通过甲基化嘧啶直接保护DNA，或者促使染色体呈致密物型对抗核酸内切酶的裂解作用［9］。本实验发现，在诱导凋亡过程中，紫杉醇处理BCap37细胞3 h时，DNA甲基化水平下降；处理12，24和48 h时，DNA甲基化水平逐渐增高，在48 h时达到高峰。但在处理72 h，细胞发生凋亡占主导时，细胞DNA甲基化水平则显著低于对照组水平。从而首次揭示在紫杉醇诱导细胞凋亡过程中，DNA甲基化水平改变与腺苷基蛋氨酸合成酶基因表达水平是基本一致的。所不同之处是在紫杉醇处理3 h时，DNA甲基化水平降低，而腺苷基蛋氨酸合成酶基因表达已开始增高［10］。作者认为，紫杉醇处理BCap37细胞诱导的腺苷基蛋氨酸合成酶基因增高导致了细胞DNA甲基化水平的升高，DNA高甲基化反应是细胞内对抗细胞凋亡反应因子的表现之一，一旦腺苷基蛋氨酸合成酶表达受到某种原因抑制而降低时，DNA甲基化水平亦明显下降，对细胞凋亡反应因子的阻抑作用消退，DNA裂解反应随之成为占主导的事件。
为说明紫杉醇诱导BCap37细胞凋亡过程中DNA高甲基化水平改变与紫杉醇独特的药理作用是否有关，本文选用5种具有不同药理作用的抗肿瘤药物，如秋水仙碱(抗微管聚集剂)、顺铂(DNA合成抑制剂)、鬼臼乙叉甙(DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂)、阿霉素(DNA和RNA合成抑制剂)、放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)。对它们诱导BCap37细胞凋亡过程中的DNA甲基化水平进行检测，结果发现，除阿霉素处理细胞DNA甲基化降低之外，其余药物组DNA甲基化水平都有不同程度增高，但与对照组比较均无统计学的差异。值得指出的是，同属抗微管作用的秋水仙碱对细胞DNA甲基化水平的影响小于紫杉醇。上述结果提示紫杉醇诱导BCap37细胞凋亡过程中所引起的DNA高甲基化反应可能与紫杉醇独特的抗微管药理作用有关。腺苷基蛋氨酸合成酶基因高表达和DNA高甲基化反应在紫杉醇诱导的细胞凋亡中的生物学意义，值得进一步研究阐明。
参 考 文 献
1 Horwitz SB,Cohen D,Rao S, et al.Taxol:mechanism of action and resistance.Monog Natl Cancer Inst,1993,15:55
2 陈丽荣，郑 树，Willingham MC,等.紫杉醇诱发人乳癌细胞凋亡的机制研究.中华肿瘤杂志，1997，19：103
3 Cheng LC,Zheng S,Raghunathan K, et al. Characterizations of taxol-induced apoptosis and altered gene expression in human breast cancer cells.Cellular Pharmacol,1995,2:249
4 Usdin E,Borchardt RT,Creveling CR.Biochemistry of S-adenosylmethionine and related compounds.P1-760 MacMillan Press,London,1982
5 Kuo KC,McCunne RA,Gehrke CW.Quantitative reversed phase high performance liquid chromatographic determination of major and modified deoxyribonucleosides in DNA.Nucleic Acids Research,1980,8:4763
6 Szfy M,DNA methylation pattern:an additional level of information? Biochem Cell Biol,1991,69:764
7 Jones PA.DNA methylation errors and cancer.Cancer Res,1996,56:2463
8 Kerr JER,Winterford CM,Harmon V.Apoptosis : its significance in cancer therapy.Cancer,1994,73:2013
9 Pogribny IP,Basnakian AG,Miller BJ, et al. Breaks in genomic DNA and within the p53 gene are associated with hypomethylation in livers of folate/methyl-deficient rats.Cancer Res,1995,55:1894
10 陈丽荣，郑 树，范伟民，等.腺苷基蛋氨酸合成酶表达在紫杉醇诱发的乳癌细胞凋亡的作用探讨.中华肿瘤杂志，1998，20：28
(收稿：1998-04-24 修回：1998-08-19)
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