粘附分子CD44v6在乳腺癌组织表达的研究

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著

作者：李金锋　张蕾　孙素莲　徐光炜　林本耀

单位：李金锋（北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院乳腺外科 北京市100036）；张蕾（北京市肿瘤防治研究所免疫室）；孙素莲（北京市肿瘤防治研究所免疫室）；徐光炜（北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院乳腺外科 北京市100036）；林本耀（北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院乳腺外科 北京市100036）

关键词：乳腺癌；CD44基因；癌转移

　　摘要　目的：探讨CD44v6基因在不同乳腺组织的表达及 其与乳腺癌淋巴结转移的关系。方法：采用免疫组 化S－P法对113例不同乳腺组织进行CD44v6表达的研究。结 果：CD44v6阳性表达率在乳腺癌组织(96.7％)明显高于乳 腺良性肿瘤(50.0％)和正常乳腺组织(13.3％)(P＜0.01)；CD44v6表 达强阳性在淋巴结转移组(92.5％)明显高于无淋巴结转 移组(30.0％)(P＜0.05)，但淋巴结转移灶(22.2％)明显低于 原发癌灶(100％)(P＜0.05)。结论：CD44v6基因高表达可作为 判断乳腺癌具有转移倾向的临床参考指标。乳腺癌 细胞CD44v6表达量增高可能是转移发生之前的事件。

Study of Expression of Adhesion Molecular CD44v6 in Breast Cancers

Li Jinfeng Zhang Lei Sun Sulian

　　（Department of Mammary Surgery, Beijing Cancer Hospital, School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing ）

　　Abstract Objective: To study the relationship between the CD44v6 expression in variant breast tissues and the lymph node metastasis of breast cancer. Methods: The CD44v6 expression in 113 samples of breast tissues were studied by immunohistochemical S－ P technique. Results: It was found that the expression of CD44v6 in breast cancers were significantly higher than those in benign breast tumor and normal breast tissue (P＜0.01). The intensive expression of CD44v6 in cases with lymph node metastases were significantly higher than those withiout metastasis (P＜ 0.05). However, the intensive expression of CD44v6 in metastatic lymph nodes were significantly lower than those in primary breast cancer tissue (P＜ 0.05). Conclusion: The results suggest that high expression of CD44v6 can be a clinical parameter of breast cancer with metastatic potential and the elevation of CD44v6 expression may take place before metastasis ocurred.

　　Key Words Breast cancer Gene CD44 Cancer metastasis

　　自从Gunther等研究发现CD₄₄v6基因能够使大鼠胰腺癌细 胞获得转移能力以来^[1]，对CD₄₄v6的研究越来越受到人 们的重视。近年来的研究认为，CD₄₄v6在多种肿瘤的发 生、发展、尤其是在肿瘤细胞的转移过程中起重要 促进作用。特别是其在胃癌和结直肠癌中的过度表 达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及患者的预后 均密切相关^[2～4]。但CD₄₄v6在乳腺癌组织中的表达，目 前国外研究尚少，且结果不甚一致，而国内尚未见 较大组别的对比研究。为进一步了解CD₄₄v6在不同乳腺 组织中的表达差异，探讨其与乳腺癌转移的关系， 我们采用S－P免疫组化染色方法，对113例不同乳腺组 织标本的CD₄₄v6表达进行分析研究。

　　1　材料与方法

　　1.1标本

　　取自1997～1998年北京肿瘤医院外科手术标本。60例乳 腺癌组织，其中40例有淋巴结或远位转移，20例无转 移；20例乳腺良性肿瘤组织，其中乳腺纤维腺瘤18例 ，导管内乳头状瘤2例；18例乳腺癌转移之淋巴结；15例 正常乳腺组织。手术切下标本于2小时内固定于10％中 性福尔马林，常规石蜡包埋、切片。

　　1.2试剂

　　鼠抗人CD₄₄v6单克隆抗体购自北京中山生物技术有限 公司，S－P试剂盒为BIOTECH公司产品。

　　1.3方法

　　免疫组化采用S－P法染色，步骤如下：4μm切片脱蜡 至水，3％H₂O₂甲醇溶液室温孵育10分钟，微波抗原修复 10分钟，室温冷却后，10％羊血清37℃孵育20分钟，滴 加一抗，工作效价1:50,4℃过夜，生物素标记羊抗鼠IgG孵 育30分钟，HRP－标记链酶卵白素孵育30分钟，DAB显色5～ 10分钟，苏木素复染后，脱水透明封片，光镜下观察 。PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4结果判断

　　CD₄₄v6为跨膜蛋白，定位于细胞膜，计细胞膜棕染为 阳性细胞。按阳性细胞数＜5％,5％～25％,26％～50％，＞50％ 分为－、＋、＋＋、＋＋＋四级。

　　1.5统计学处理

　　χ2检验。

　　2结果

　　2.1　CD₄₄v6基因在乳腺恶性、良性肿瘤和正常乳腺组织 中的表达差异

　　见表1。乳腺癌组织CD44v6的表达阳性率显著高于乳腺 良性肿瘤，二者有极显著性差异(P＜0.01)，同时染色强 度前者重于后者，两组强阳性(＋＋～＋＋＋)病例比 较有显著性差异(P＜0.05)（图1,2），15例正常乳腺组织 中仅2例有弱表达(＋)。

表1　CD₄₄v6基因在乳腺恶性、

　　良性肿瘤和正常乳腺组织中的表达差异

　　*乳腺癌与良性肿瘤两组阳性率比较P＜0.01,

　　强阳性 (＋＋～＋＋＋)率比较P＜0.05

图1乳腺癌组织CD44v6(＋＋ ＋)S－P×250

图2乳腺纤维腺瘤CD44v6(－)S－P×125

　　2.2　CD₄₄v6基因表达与乳腺癌腋窝 淋巴结转移的关系

　　见表2。40例有腋窝淋巴结转移病例中，37例CD44v6表达 强阳性（92.5％），而20例腋窝淋巴结转移阴性病例中 仅6例(30.0％)表达强阳性，两组比较差异显著(P＜0.05)。

表2　CD₄₄v6基因表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移的关系

　　IHC:免疫组织化学染色

　　*转移阳性、阴性两组强阳性率比较P＜0.05

　　2.3　原发 癌与转移癌组织中CD44v6基因的表达差异

　　同时对18例乳腺原发癌和相应之淋巴结转移灶进行 对比研究，结果转移灶CD44v6基因表达强阳性率(22.2％)明 显低于原发癌(100％)，两组比较有显著性差异(P＜0.05)（ 表3，图3,4）。

表3　乳腺原发癌与转移癌组织中CD44v6基因的表达差异

　　IHC:免疫组织化学染色

　　*原发癌和转移灶两组强阳性率比较P＜0.05

图3　乳腺癌原发灶CD₄₄v6(＋＋＋)S－P×250

图4　乳腺癌淋巴结转移灶CD44v6(－)S－P×250

　　3　讨论

　　CD₄₄基因含有20个高度保守的外显子(Exon)，其中组成型 10个，仅含组成型Exon的转录子称为标准型(CD₄₄s)，在组 成型Exon之间，还有10个可拼接Exon，它们在转录时可发 生变异拼接，产生多种拼接变异体转录子(CD₄₄v)，CD₄₄基因是粘附分子家族成员之一，其编码的跨膜糖蛋白 为细胞外基质－透明质酸的受体，参与体内多种正 常生理功能。早在1980年Dall等^[5]即指出，CD₄₄分子不但在 淋巴细胞功能及与细胞间质相互作用中，而且在肿 瘤生长和转移过程中也起重要作用。在众多CD₄₄变异 体中，对v6的研究较为深入，目前比较肯定的是CD₄₄v6表 达与胃癌和结直肠癌的转移及对预后的影响密切相 关^[2～4]。

　　本研究结果发现，乳腺癌组织CD₄₄v6的表达明显高于 良性肿瘤，说明乳腺良恶性肿瘤间CD₄₄v6的表达量存在 明显差别，但良性肿瘤中亦有3例出现较强水平(＋＋)的表达，也说明v6并不能作为区分良恶性肿瘤的指标 。本组正常乳腺组织亦有2例出现CD₄₄v6弱表达，与部分 正常肌上皮细胞存在CD₄₄v6表达有关^[5]。

　　本研究还发现CD₄₄v6基因在乳腺癌组织中普遍表达， 但其表达量在有淋巴结转移和无淋巴结转移的两组 病例中有明显差别，有转移者染色强度明显高于无 转移者（P＜0.01），说明CD₄₄v6高表达可作为乳腺癌是否 具有转移倾向的临床参考指标。既然CD₄₄v6基因在乳腺 癌的原发灶高表达，那么在其转移灶的表达情况又 如何呢？为此我们对18例乳腺癌的原发灶及其相应转 移灶进行了对比研究，结果转移灶CD₄₄v6的表达水平反 而低于原发灶，其机理可能是CD₄₄v6表达水平增高是转 移发生之前的事件，一旦细胞转移出去形成瘤灶， 其表达量反而降低。Ladeda的实验亦观察到，已形成转 移的肿瘤细胞与转移早期的肿瘤细胞比较，CD₄₄表达信号下调，Western blot证实CD₄₄表达量亦相应降低^[6]。Coppola检 测34例有淋巴结或肝转移的结直肠癌标本，CD₄₄v6在原发灶表达阳性率为100％，而转移灶仅为38％，且仅4％ 呈中～强阳性^[7]，对某些癌前病变（如膀胱结构不良 区、结肠腺瘤）及早期癌的研究提示，在肿瘤形成 初期，随着肿瘤的增大，CD₄₄表达异常愈加明显；而 晚期肿瘤，尤其瘤细胞已达器官边缘或已经浸润周围组织时，在浸润最深部位，CD₄₄的表达可减少到测 不出的水平^[8]。由此可见，在肿瘤形成、发展过程中 ，CD₄₄分子的表达是一种相当复杂的病理过程，其不 但与肿瘤类型有关，且在肿瘤发展的不同时期，其表达量亦发生变化。

　　最近有报道，利用CD₄₄v6反义mRNA处理转移性结肠癌细 胞系HT29，使其CD₄₄v6表达下调，结果致该细胞系成瘤能 力明显降低，向裸鼠脾脏注射未经处理的HT29细胞后 ，经4个月观察发现，注射部位有82％成瘤，30％出现肝转移；而经CD₄₄v6反义mRNA处理后的HT29细胞再注射裸鼠 ，注射部位和肝脏均未发现肿瘤形成^[9]。此亦证明 CD₄₄v6基因对转移形成的重要作用，同时提示CD₄₄v6单抗 或能抑制肿瘤转移而有广阔临床应用前景。

　　关于CD₄₄v6分子的作用机理目前尚不很清楚，有研究 发现其能协助基质金属蛋白酶9(MMP－9)促进细胞外Ⅳ型胶原的降解，从而介导肿瘤细胞的浸润和转移^[10]。 相信随着对CD₄₄分子研究的不断深入，其对肿瘤细胞 生物学行为的影响将日趋明了。

(范锡凤校对)

　　本文课题受北京市乳腺癌重点学科发展基金资助

　　参考文献

　　1，Gunther U,Hofmann J,Rudy W,et al.A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell,1991;65:13

　　2，Saito H,Tsujitani S,Katano K,et al. Serum concentration of CD44 variant 6 and its relation to prognosis in patients with gastric carcinoma. Cancer,1998;15:1094

　　3，Yamamichi K,Uehara Y,Kitamura N,et al. Increased expression of CD44v6 mRNA significantly correlates with distant metastasis and poor prognosis in gastric cancer. Int J Cancer,1998;19:256

　　4，Bhatavdekar JM,Padel DD,Chikhlikar PR,et al. Overexpression of CD44:a useful independent predictor of prognosis in patients with colorectal carcinoma. Ann Surg Oncol,1998;5:495

　　5，Dall P,Heider KH,Sinn HP,et al. Comparison of immunohistochemistry and RT－ PCR for detection of CD44v－ expression,a new prognostic factor in human breast cancer. Int J Cancer,1995;60:471

　　6，Ladeda V,Aguirre U,Ghiso JA,et al. Function and expression of CD44 during spreading,migration,and invasion of murine carcinoma cells. Exp Cell Res,1998;242:515

　　7，Coppola D,Hyacinthe M,Fu L,et al. CD44v6 expression in human colorectal carcinoma. Hum Pathol,1998;29:627

　　8，Goodison S,Tarin D. Current status of CD44 variant isoforms as cancer diagnostic markers. Histopathology,1998;32:1

　　9，Reeder JA,Gotley DC,Walsh MD,et al. Expression of antisense CD44 variant 6 inhibits colorectal tumor metastasis and tumor growth in a wound environment. Cancer Res,1998;58:3719

　　10，Yu Q,Stamenkovic I.Localization of matrix metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44－ mediated tumor invasion. Genes Dev,1999;13:35

(1999－08－06收稿)

　　(1999－10－06修回)