腋淋巴结阴性乳腺癌血管生成与预后相关性研究
癌症 1999年第5期第18卷 基础研究
作者：胡卫东 杨国樑 袁宏银 张峰
单位：湖北医科大学第二附属医院肿瘤科(武汉，430071)
关键词：血管生成；微血管/病理；乳腺肿瘤；血管内皮生长因子；预后
【摘 要】 目的：探讨血管生成与腋淋巴结阴性乳腺癌（ANNBC）临床病理及预后关系，为ANNBC寻求一种新的预后因子。方法：选择80例随访资料完整的根治或改良根治术后的ANNBC女病人（中位随访期8年，35例术后实施了辅助治疗，45例未接受辅助治疗）的石蜡标本，用免疫组化方法染色微血管及检测血管内皮生长因子（VEGF）表达，单因素和多因素方法分析肿瘤微血管密度（MVD）和VEGF的表达对ANNBC预后的关系。结果：全部病例MVD平均值为35.99±20.27，VEGF阳性率为36.25％，两者均与一般临床病理因素无关，高复发转移组或VEGF表达阳性组MVD显著高于无病生存组或VEGF表达阴性组（P＜0.01），高MVD组（MVD＞35）或VEGF阳性组OS和DFS曲线低于低MVD组（MVD≤35）及VEGF阴性组，有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01），对术后未加辅助治疗的45例病人分析，其结果也一致。分析术后加辅助治疗的35例患者，只有VEGF阴阳两组间DFS有差异。结论：VEGF阳性表达者血管生成活跃，MVD值高，高MVD、VEGF表达阳性的ANNBC预后差，术后应行辅助治疗，尤其应考虑行抗血管治疗。
中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0566-04
Prognostic significance of microvessel density and the expression of vascular endothelial growth factor in axillary-node-negative breast cancer
HU Wei-Dong，YANG Guo-Liang，YUAN Hong-Yin，et al.
Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071，P.R. China
【Abstract】 Objective：To determine the relation of microvessel density (MVD) and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) with the prognosis of axillary-node-negative breast carcinoma (ANNBC) for searching for new prognostic factors.Methods：Eighty specimens resected from patients with ANNBC were investigated by staining with a monoclonal antibody against FVⅢ-RA and polyclonal antibody against VEGF. Correlations between the expression of VEGF,MVD and several of clinicopathologic factors were studied.Results：The mean of MVD was 35.99± 20.27 in all patients.The positive rate of VEGF was 36.25％ . Both of them were not correlated with the clinicopathological factors. MVD was significantly higher in VEGF-positive tumors or relapsed or metastatic group than in VEGF-negative tumors or disease-free survival group. Moreover, patients with higher MVD or VEGF positive tumors had lower disease-free survival (DFS) or overall survival (OS) than those with lower MVD or VEGF-negative tumors. When those (45 cases) without adjuvant therapies after surgery were analyzed, the results were the same.But OS of them (35 cases) with adjuvant therapies had no significiant difference between high and low MVD group,and between VEGF positive and negative group. DFS was the same among VEGF positive and negative group. Multivariate analysis indicated that MVD,the expression of VEGF and tumor size were independent prognostic factors in patients with ANNBC.Conclusions：MVD,the expression of VEGF may be good prognostic indicators for patients with ANNBC and adjuvant therapies after surgery or antiangiogenic therapy may be useful to improve the prognosis of patients with high MVD or VEGF-positive tumors.
Keywords：Angiogenesis;Capillaries;Vascular endothelial growth factor;Breast neoplasms;Prognosis
腋淋巴结有否转移通常被认为是乳腺癌预后的最重要因素，然而淋巴结无转移者仍有20％～30％病人在手术治疗后10年内复发、转移或死亡〔1〕。对所有腋淋巴结阴性乳腺癌（axillary node-negative breast carcinoma,ANNBC）行术后辅助治疗，可提高总体生存率，但可能造成70％左右的低危人群接受了不必要的药物或放射损伤。很多证据表明，血管生成是实体瘤生长和转移的必要条件〔2〕。我们通过检测瘤内微血管密度（microvessel density,MVD）和血管内皮生长因子（vascular growth factor,VEGF）的表达，分析它们与ANNBC的预后关系，试图寻找新的预后因子，为合理地应用术后辅助治疗提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 病例的选择
全部病例选自湖北医科大学第二附属医院1988～1993年间住院病人，合乎筛选条件的共80例，均为女性病人，年龄27～80岁，中位年龄52岁。按下列条件筛选：①行乳腺癌根治或改良根治术；②肿瘤原发灶蜡块保存良好；③术中术后解剖分离淋巴结在6枚以上；④病理诊断淋巴结阴性；⑤随访资料完整。
本实验生存期全部以手术日开始计算，最短随访期5年，最长10年，中位随访期8年。术后无任何辅助治疗45例,加足量足程的化疗或放疗或内分泌疗法三者至少有一者的35例。
1.2 试剂和方法
主要试剂：鼠抗人FVⅢ-RA单克隆抗体，工作浓度1∶150，兔抗人VEGF多克隆抗体，工作浓度1∶100，显色剂DAB，以上试剂均为美国Santa公司产品，SABC试剂盒购自武汉博士德生物制品公司。
方法：石蜡块脱蜡重新包埋，以恢复抗原性，切片厚4μm，采用免疫组织化学SABC方法，每次试验以PBS替代一抗作阴性对照。
1.3 切片观察及结果判断
①参照Bosai等〔3〕方法，在200倍视野下选免疫组化切片微血管最密集的3个热点（hotspot）计数微血管数，取其平均值即为该切片的MVD值。
②参照MatternJ等〔4〕评分方法，分别对染色强度和染色阳性细胞百分比评分，分别分0,1,2,3,四个层次，每张切片两种积分相加以总积分0～2计为VEGF表达阴性，3～6计为VEGF表达阳性。
1.4 统计学处理
MVD以
表达，采用的统计方法有t检验，χ2检验等。预后单因素分析采用Kaplan-Meier生存率分析法和Log-rank检验，多因素分析采用COX比例风险模型。全部资料用SASversion6.04统计。
2 结果
2.1 MVD、VEGF表达与临床病理因素间的关系
免疫组化FVⅢ-RA抗体染色后微血管内皮细胞呈棕黄色，(见图1)。VEGF表达于瘤细胞胞浆和胞膜，DAB显色呈浅黄色，(见图2)。80例ANNBCMVD平均值是35.99±20.27，VEGF阳性率36.25％(29/80)。将各临床病理因素如肿瘤大小（cm）分成＜2，2～5，＞5三组，组织学分级分成1、2、3级，病理类型分成浸润性导管癌、浸润性小叶癌，其它,三种类型，内分泌状况分成绝经前和绝经后，年龄（岁）分成≤50，＞50，比较各组中MVD和VEGF表达阳性率，结果各临床病理因素之间两项指标均无统计学关系。
2.2 VEGF表达与MVD关系
29例VEGF表达阳性患者MVD值范围16～20（均值57.14±30.98）,51例VEGF表达阴性患者MVD值范围4～53（均值23.96±12.96）,两者具极显著统计关系（P＜0.001）。说明VEGF阳性表达者肿瘤血管生成活跃，微血管密度高。
图1 FVⅡ-RA抗体SABC免疫组织化学方法显示肿瘤内微血管生成活跃，10×20
图2 VEGF抗体SABC免疫组织化学方法染色，VEGF表达于乳腺癌细胞浆和胞膜，10×20
2.3 血管生成与预后关系
80例ANNBC中复发转移者29例（29/80，36.25％），无瘤生存者51例（51/80,63.75％）。前者MVD均值是后者的3倍，VEGF表达阳性率则高于后者3倍，说明术后复发转移者血管密度显著高于无瘤生存者，而且两者促血管生成因子表达也有显著差异，VEGF与MVD有近似直线关系。见表1。
表1 MVD、VEGF表达与复发转移关系
|
项 目 |
例数 |
MVD |
VEGF表达阳性率 |
|
复发转移 |
29 |
65.23±31.25△ |
68.97％(20/29)△ |
|
无瘤生存 |
51 |
20.91±10.54 |
17.65％(9/51) |
△P＜0.01 将MVD按＞35和≤35分为高低两组，VEGF表达分成阴性和阳性两组，分别比较各自的总体生存率（overall survival,OS）和无病生存率（disease-freesurvival,DFS）（此处无病生存即指未带瘤生存）。结果表明，对全部病例分析和对术后未加辅助治疗45例单独分析，高MVD和VEGF阳性之OS、DFS曲线分别低于低MVD、VEGF阴性之OS、DFS。而术后加辅助治疗的35例患者MVD高低两组OS曲线，DFS曲线均无统计学差异（P＞0.05），VEGF阴性阳性两组仅DFS有统计学差异，VEGF阴性无瘤生存曲线高，见表2。
表2 各层次MVD两组和VEGF两组的OS、DFS比较结果
|
项 目 |
例数 |
|
OS |
DFS |
| 全部观察病例 |
80 |
MVD |
＋ |
＋＋ |
| |
|
VEGF |
＋ |
＋＋ |
| 术后未加辅助冶疗 |
45 |
MVD |
＋＋ |
＋＋ |
| |
|
VEGF |
＋＋ |
＋＋ |
| 术后加辅助治疗 |
35 |
MVD |
- |
- |
| |
|
VEGF |
- |
＋ |
注：-表示P＞0.05，＋表示P＜0.05，＋＋表示P＜0.01
2.4 COX模型多因素分析
对组织学分级、病理类型、内分泌状况、年龄、MVD、VEGF表达、肿瘤大小等7种因素量化后导入COX比例模型分析，结果只有后三者是影响ANNBC预后的独立因素，其风险比例（RR）分别是2.266、2.411、1.819，P值分别是0.0057、0.0034、0.012。
3 讨论
自1991年Weidner等〔5〕提出浸润性乳腺癌的肿瘤血管生成与其转移有关以来，很多学者就乳腺癌的血管密度与肿瘤的恶性进程作了相关性研究。但尚未见文献对ANBC的微血管密度与血管生成因子在癌组织中的表达的相互关系对预后的影响进行研究。本文从血管生成两个方面进行研究，可能更有说服力。FVⅢRA最先被Tannenbaum等〔6〕发现,具有较好的特异性和敏感性，为很多研究者采用。
80例ANNBC10年内所有复发转移者MVD平均值65.23，是无瘤生存者（20.91）的3倍，说明复发转移者血管生成明显活跃于预后好者。将MVD以平均值（35）为界分为高MVD组和低MVD两组，高MVD组的DFS、OS生存曲线与低MVD组比较有统计学显著性差异。为了排除术后辅助治疗可能给各生存曲线带来的影响，对术后未加辅助治疗的45例病人单独分析，OS，DFS有高度显著性统计学差别。而对术后加辅助治疗者分析则高MVD和低MVD两组的生存率无差别，（P＞0.05），提示辅助治疗可降低复发和转移，提高生存率。COX模型分析也证实了MVD是估计ANNBC预后的独立因素。本实验结果与多数学者的结论一致，即MVD不仅是乳腺癌也是ANNBC有用的预后预测因子。
近来，几种血管生成促进因子得以分离，如VEGF、bFGF、HGF、PDGF等。VEGF现被认为是促血管生成最重要的一种因子〔7〕。它既能增加微血管的通透性，也能诱导内皮细胞有丝分裂和增殖。本实验表明，虽然VEGF总阳性率只有36.25％，但复发转移的29例ANNBCVEGF表达阳性率达68.97％，大大高于无病生存者（17.65％）(P＜0.01)，说明VEGF表达与复发转移具直接关系。我们还发现VEGF表达阳性者，MVD值高于VEGF表达阴性者2倍多（P="0.001）"，提示VEGF表达与MVD有密切联系，证实了VEGF促血管生成的重要作用。分析VEGF表达阳性和阴性两者KaplanMeier生存曲线，无论对术后是否作辅助治疗分层，VEGF表达阳性者DFS和OS均低于VEGF表达阴性者（P＜0.05或P＜0.01）。（仅术后加辅助治疗分层VEGF阴阳性两组的OS无差别）。COX模型分析中，前者复发转移风险是后者的2.411倍。因此，可以认为，VEGF阳性表达提示ANNBC预后不良。 此外，我们发现VEGF表达、MVD与一般临床病理因素无关，而COX模型多因素分析中除MVD、VEGF外，只有肿瘤大小是ANNBC预后独立因素。因此，如果将血管生成情况与肿瘤大小结合分析预后，可能更准确。
内乳淋巴结同腋淋巴结一样也是乳腺癌转移途径中的第一站，左文述等〔8〕综合文献认为内乳淋巴结单独转移者仅占1.8％～5.3％。因此，可以认为本组资料的ANNBC仅可能有个别出现内乳淋巴结转移，不会对总体DFS或OS产生影响。而且Bosari等〔3〕研究发现淋巴结阳性的乳腺癌MVD比阴性者显著增高，血管生成活跃，一方面供氧和营养丰富，利于细胞生长；另一方面易使脱落瘤细胞增加经血管或淋巴管转移的机会。血管生成在预后的重要预测作用中是对淋巴结作用的补充，且更优于后者。
本研究结果如在进一步的前瞻性、大样本研究中得以证实，则对高MVD或VEGF表达阳性者的ANNBC患者，应考虑辅以术后补充治疗。而对低MVD或VEGF表达阴性者可不予补充治疗，但应定期随访。这样合理运用术后辅助治疗，可以减少盲目性，提高生存率和生存质量。另外抗血管治疗作为新兴的治疗手段，近年来正逐渐被人们认识。本实验中，35例术后接受了辅助治疗的患者，VEGF表达低或阴性者DFS仍高于VEGF阳性者（P＜0.05），推测术后放疗、化疗或内分泌治疗虽可杀灭或抑制肿瘤细胞，但对抑制、破坏肿瘤微血管作用有限。选择血管生成活跃的患者在经以往的治疗手段基础上加抗血管治疗有可能取得更满意效果。
〔参考文献〕
〔1〕 McGuire WL,Clark GM. Prognostic factors and treatment decisions in axillary-node-negative breast cancer〔J〕. N Engl J Med,1992,326：1756～ 1761.
〔2〕 Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?〔J〕. J Natl Cancer Inst,1990,82：4～6.
〔3〕 Bosari S,Lee AK,De Lellis RA,et al. Microvessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma〔J〕. Human Pathol,1992,23：755～761.
〔4〕 Mattern J,Koomagi R,Volm M. Association of vascular endothelial growth factor with intratumoral microvessel density and tumor cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma〔J〕. Br J Cancer,1996,73：931～934.
〔5〕 Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma〔J〕. N Engl J Med,1991,324：1～8.
〔6〕 Tabbebbayn SH,Rick ME,Shafer B,et al. Subendothelial matrix of cultured endothelial cells contains fully processed high molecular weight von Willebrand factor〔J〕. J Lab Clin Med,1989,113：372～378.
〔7〕 Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al. Vascular permeability factor/vascula endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability,and angiogenesis〔J〕. Am J Pathol,1995,146：1029～1039.
〔8〕 左文述，徐忠法，刘奇主编.现代乳腺肿瘤学〔M〕.山东科学技术出版社.1996：99～111.
收稿日期：1998-07-10；修回日期：1998-12-15
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