乳腺癌染色体3P^14－24区域不同位点杂合缺失的初步分析

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第10期

王洪义　吕有勇　崔建涛　何洛文　林本耀　徐光炜

　　摘　要　目的：研究染色体杂合缺失与乳腺癌生物学行为和预后的关系。方法：应用PCR－限制性长度片段多态性分析(PCR－RFLP)的方法，对56例原发性乳腺癌患者3号染色体短臂3P^14－24区域杂合缺失（LOH）进行分析。结果：在染色体3P¹⁴、3P²¹、3P²⁴三个位点上LOH发生的频率分别为4.2％(1/24)、0(0/9)和39.5％(15/38)，3P²⁴位点LOH发生的频率最高，说明该位点有乳腺癌相关抑制基因存在的可能性。分析3P²⁴位点的LOH与临床分期、淋巴结转移和ER、PR的相关关系，发现在8例Ⅰ期乳腺癌信息个体中该位点LOH全部为阴性，在Ⅱ、Ⅲ期病例LOH阳性率分别为52.2％(12/23)和42.8％(3/7)；在腋淋巴结转移和无转移组病例中分别为66.7％(12/18)、15％(3/20)，两组间有显著性差异（P＜0.01）；ER或PR阴性的乳腺癌也较ER、PR阳性者有较高的LOH发生率。说明在Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌以及淋巴结阳性、ER或PR阴性的肿瘤中该位点的缺失更频繁，提示3P²⁴位点基因缺失与病程进展快、侵袭性程度高和预后差的肿瘤有关。结论：通过检测染色体3P²⁴位点的LOH可以推测肿瘤转移的潜能和估计患者的预后。

　　关键词：乳腺癌　3号染色体短臂　杂合缺失

　　研究证明，多数恶性肿瘤常存在一个或几个染色体等位基因的缺失，在缺失的DNA片段中可能含有与肿瘤发生和演变密切相关的抑癌基因^[1]。近年，人3号染色体短臂（3P）不同位点杂合缺失（LOH）分析及其与某些恶性肿瘤关系的研究颇受重视。本文应用PCR－RFLP方法检测56例乳腺癌组织中3P^14－24区域不同位点的LOH，初步分析基因缺失的部位及其与乳腺癌生物学行为的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床资料

　　56例乳腺癌及正常皮肤组织标本来自我院外科，按常规方法提取组织DNA。全组病例均为女性，年龄30～71岁。采用葡聚糖饱和分析法测定雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）含量。按TNM分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期35例，Ⅲ期9例。

　　1.2　PCR引物

　　用于3P²⁴、3P²¹、3P¹⁴三个位点LOH测定所使用的引物名称分别为EAβMD－1/4、EAβH－3/4、D3S2－1/2和D3S30－1/2，PCR产物片段长度及所用限制性内切酶见表1。

表1乳腺癌染色体3P^14－24区域不同位点LOH发生频率比较

引物名称	染色体位点	PCR产物	限制性	LOH/信息
		片段长度(bp)	内切酶	个体(％)
EAβMD－1	3P24	210/123＋87	MspⅠ	10/26
EAβMD－4				(38.5)
EAβH－3	3P24	208/135＋73	HindⅢ	8/19
EAβH－4				(42.1)
D3S2－1	3P21	473/236＋237	MspⅠ	0/19
D3S2－2				(0)
D3S30－1	3P14	293/224＋69	MspⅠ	1/24
D3S30－2				(4.2)

　　1.3　PCR－RFLP分析

　　将0.1μg样品DNA加入10μg PCR反应液中（内含50μmol上游及下游引物、0.1mmol dNTP、2.5mmol/L MgCl₂以及Taq DNA聚合酶0.5U)于94℃变性2分钟后，使反应物进行35个循环的变性（94℃、15秒）、复性（62℃、15秒）和延伸反应（72℃、15秒），在最后一个循环后，试管仍置于72℃继续反应10分钟。取5μlPCR反应液，加入10U相应的限制性内切酶，在37℃水浴中消化过夜，酶解后的DNA片段在含0.5μg/ml溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶中进行电泳分离。电泳后若形成两条区带，该标本为信息个体，通过比较信息个体病例的正常及癌组织DNA电泳片段大小以及量的差异就可以推算出是否存在LOH^[2]。

　　1.4　统计学分析

　　采用配对资料的χ²检验法进行显著性检验。

　　2　结果

　　56例原发性乳腺癌组织标本中3P²⁴、3P²¹、3P¹⁴三个不同位点LOH的分析结果显示：3P²⁴EAβMD和EAβH两个基因位点有显著高的LOH发生率，分别为38.5％(10/26)和42.1％(8/19)；在3P²¹D3S2基因位点的19例信息个体中全部为LOH阴性；在24例信息个体中仅1例呈现3P14D3S30位点的LOH，占4.2％(1/24)（表1、附图）。

附图乳腺癌患者3P²⁴位点的LOH测定。正常（N)及肿瘤(T)

　　组织DNA用引物MD－1/MD－4进行PCR－RFLP分析。1、2、

　　5、6、7号患者为LOH阳性，4号为非信息个体，3、8号为LOH阴性，A为分子量标志

　　在56例乳腺癌中3P²⁴位点上共产生信息个体38例，15例呈现LOH，占39.5％(15/38)。分析该位点LOH与乳腺癌临床分期、淋巴结转移及ER、PR的关系发现，3P²⁴位点LOH皆发生在Ⅱ、Ⅲ期病例，分别为52.2％和42.8％，8例Ⅰ期乳腺癌全部为阴性；在腋淋巴结转移和无转移组病例中分别为66.7％和15％，两组间有显著性差异（P＜0.01）；ER或PR阴性组的LOH阳性率也显著高于阳性组（表2）。说明在Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌以及淋巴结阴性、ER或PR阴性的肿瘤中该位点的缺失更频繁，提示3P²⁴位点等位基因缺失与病程进展快、侵袭性程度高和预后差的肿瘤有关。

表2乳腺癌3P²⁴位点LOH与临床参数的关系例(％)

临床参数		总例数	3P24
			LOH阳性	LOH阴性
TNM分期	Ⅰ	8	0(0)	8(100)
	Ⅱ	23	12(52.2)	11(47.8)
	Ⅲ	7	3(42.8)	4(57.2)
淋巴结转移	阳性	18	12(66.7)	6(33.3)
	阴性	20	3(15)	17(85)
ER	阳性	22	7(31.8)	15(68.2)
	阴性	16	8(50)	8(50)
PR	阳性	21	5(23.8)	16(76.2)
	阴性	17	10(58.2)	7(41.2)

　　3　讨论

　　染色体缺失或染色体结构异常是人类肿瘤细胞重要的生物学特征之一，是遗传不稳定性的标志。染色体上特定区域等位基因的缺失可能提示有抑癌基因的丢失，这被认为是人类肿瘤发生的一个重要机制^[1]。染色体3P上基因缺失与人类肿瘤关系的研究是当今的热点之一，对这一区域的LOH分析表明，许多肿瘤存在等位基因的缺失，在小细胞肺癌、肾癌和宫颈癌，3P区域缺失的检出率达100％，推测该区域可能含有与人类肿瘤有关的抑癌基因^[3～5]。目前已证明，肺癌最小的共同缺失区位于3P²¹。本研究结果显示，染色体3P也是乳腺癌易发生基因缺失的区域，在3P¹⁴、3P²¹和3P²⁴三个位点LOH发生的频率分别为4.2％、0和39.5％，3P²⁴位点LOH发生的频率最高，表明乳腺癌3P上共同的缺失区可能位于3P²⁴附近，也提示该区域有乳腺癌抑制基因存在的可能性，为新的抑癌基因的分离和克隆提供了线索。

　　本研究结果表明，3P²⁴位点LOH是与乳腺癌生物学行为和预后有关的肿瘤基因标志，在Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌、淋巴结转移阳性及ER、PR阴性的肿瘤中3P²⁴位点LOH发生率显著增高，说明该位点等位基因缺失与病程进展快、侵袭性程度高和预后差的肿瘤有关。在淋巴结转移和无转移组中，3P24位点LOH发生率分别为66.7％和15％，两组间具有显著性差异，提示该位点可能存在与肿瘤细胞浸润转移有关的抑癌基因，通过检测该位点LOH可以推测肿瘤发生转移的潜能，判别那些生物学行为和预后更差的乳腺癌患者。

　　作者单位：北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所（北京市100036）

参考文献

　　1 Solomon E,Borrow J,Goddard A,et al. Chromosome aberrations and cancer. Science,1991;254:1153

　　2 You Yong Lu, Jhanwar SC,Testa JR,et al. Deletion mapping of the short arm of chromosome 3 in human malignant mesothelioma. Genes Chromosome ＆ Cancer,1994;9:76

　　3 Yokota J,Tsukada Y,Nakajima T,et al. Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in carcinoma of uterine cervix. Cancer Res,1989;49:3598

　　4 Hibi K,Takahashi T,Yamakawa K,et al. Three distinct regions involved in 3P deletion in human lung cancer. Oncogene,1992;7:445

　　5 Zbar B,Brauch H,Talmadge C,et al. Loss of alleles of loci in the short arm of chromosome 3 in renal cell carcinoma.Nature,1987;327:721