顾军　周颖奇　褚云宏

　　摘　要　目的：观察促性腺激素释放激素(LHRH)高效类似物那法瑞林对人乳腺癌BCaP-37细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用并探讨其作用机制。方法：那法瑞林用药分为移植瘤接种后次日给药组及接种后2周给药组，每组各设3个剂量，均连续皮下给药4周。使用他莫昔芬和另一LHRH激动剂D-Trp⁶ LHRH作为阳性对照。用药结束后，分别测定移植瘤、双侧卵巢、子宫质量和血清雌二醇(E₂)含量；进行病理检查(包括电镜)；测定移植瘤细胞DNA指数(DI)；观察瘤细胞增殖周期比例的变化。结果：(1)在以上不同的两用药组中，那法瑞林剂量在500和1000μg/kg时，可以显著抑制移植瘤的生长，移植瘤的DI值明显下降，通过电镜观察到瘤组织内存在凋亡的瘤细胞。同时，动物的卵巢质量和血清E₂含量显著下降。(2)他莫昔芬30mg/kg对移植瘤生长无显著影响，与D-Trp⁶ LHRH 抑制移植瘤生长的作用相比亦无显著差别。结论：那法瑞林长期皮下给药对BCaP-37移植瘤生长有显著的抑制作用。

　　 　　关键词：促性腺激素释放激素　乳腺肿瘤　那法瑞林

　　乳腺癌的内分泌治疗，由于具有低毒、有效的特点，已广泛应用于临床。其中，促性腺激素释放激素 (LHRH)类似物目前已作为一线药物用于临床。我们利用人乳腺癌BCaP-37细胞裸鼠移植瘤模型，对LHRH高效类似物那法瑞林抑制乳腺癌生长的作用进行了研究。

　　 1　材料和方法

　　1.1　动物模型及药物　4～6周龄BALB/c雌性裸鼠，体质量约20g。右侧腋部皮下注射接种体外培养的人乳腺癌BCaP-37细胞1×10⁷个/只，成瘤后连续传代，第3代进行特征鉴定。取第11代移植瘤组织，制成细胞悬液，5×10⁶个(0.2ml)接种至裸鼠皮下。他莫昔芬购自上海第十二制药厂，那法瑞林、D-Trp⁶LHRH购自上海东风生化试剂公司。

　　1.2　那法瑞林治疗观察　那法瑞林和阳性对照药物他莫昔芬的使用分成移植瘤接种后次日开始(Ⅰ组)和接种后2周开始(Ⅱ组)，均为皮下注射，1次/d，连续4周。那法瑞林的剂量Ⅰ组分别为250，375，500μg/kg；Ⅱ组分别为250，500，1000μg/kg。他莫昔芬在Ⅰ，Ⅱ组的用量均为30mg/kg。

　　1.3　D-Trp⁶LHRH与那法瑞林对比观察　移植瘤接种后次日起分别每日皮下注射D-Trp⁶ LHRH或那法瑞林，剂量均为500μg/kg，连续6周。

　　1.4　观察指标　用药结束后，断颈处死动物，分别测定移植瘤、双侧卵巢及子宫的质量，计算抑瘤率；放免法测血清雌二醇(E₂)含量。各组移植瘤标本行病理检查。用CAS图像分析仪测定移植瘤细胞DNA含量及DNA指数(DI)，每张切片计算50个细胞。利用流式细胞术观察瘤细胞增殖周期比例的变化。

　　1.5　统计学处理　采用非配对的t检验。

　　 2　结　果

　　2.1　那法瑞林对BCaP-37移植瘤生长及裸鼠卵巢、子宫质量、血清E₂水平的影响　如表1所示，移植瘤接种后次日开始给药，连续4周，那法瑞林500μg/kg组与对照组相比，瘤质量显著减轻(P＜0.01)，其抑瘤率为73.6%；那法瑞林 250，375μg/kg组及他莫昔芬30mg/kg组对移植瘤的生长均无显著抑制作用，卵巢质量则随那法瑞林的剂量增加呈现减轻趋势，在375及500μg/kg组之间出现显著性差异(P＜0.05,P＜0.01)；他莫昔芬30mg/kg组的卵巢质量也出现显著性减轻(P＜0.05)，子宫质量无显著变化，血清E₂水平在那法瑞林500μg/kg组呈下降趋势，但未见显著性差异。

表1　那法瑞林或他莫昔芬接种后次日给药对移植瘤、卵巢及子宫质量和血清E₂水平的影响

　　Tab 1　Effect of nafarelin or tamoxifen administrated after tumor inoculation on tumor, ovarian, uterine mass and serum E₂ level of the mice with BCaP-37 breast tumor

(±s)

　　(m/mg)

　　(m/mg)

　　(c_B/pmol·L^－1)

^*P＜0.05, ^**P＜0.01 vs control group；^a:n=6

　　移植瘤接种后2周开始给药的结果见表2。那法瑞林1000μg/kg组的瘤质量与生理盐水对照组相比显著减轻(P＜0.05)，抑瘤率为45.0%；而250与500μg/kg两剂量则只有抑制趋势，与对照组比较无显著性差异。他莫昔芬30mg/kg组对肿瘤的生长也无显著的抑制作用。裸鼠的卵巢和子宫质量随那法瑞林剂量的增大，有逐渐减轻的趋势，在1000μg/kg剂量组卵巢质量出现非常显著的下降(P＜0.01), 与之相对应的血清E₂含量也降至检测范围的低限(18.35pmol/L)以下(P＜0.01)。

　　D-Trp⁶LHRH与那法瑞林500μg/kg连续使用6周后比较，两种药物对移植瘤生长均有显著的抑制作用，瘤质量显著减轻(分别为P＜0.05,P＜0.01)；两种药物之间差异无显著性。

　　2.2　那法瑞林作用后的病理组织学变化　大体观察：各组瘤组织呈结节状，无包膜，切面为淡红色鱼肉状组织，对照组与治疗组之间无明显差异。光镜下观察：对照组瘤细胞呈巢状或条束状分布，细胞核大、染色深、并可见核分裂相，近中央部分可见较多的嗜酸性物质并有变性退化细胞。在那法瑞林治疗后出现明显抑瘤作用的剂量组中，瘤组织基本形态无明显变化，部分切片镜下可见较多的核固缩的变性细胞。透射电镜观察：对照组瘤组织的瘤细胞核大而显著畸形，核膜多处凹陷，内质网及线粒体丰富、有扩张，胞质内有密度较高的颗粒，细胞间有腔隙形成。那法瑞林1000μg/kg治疗组瘤组织电镜观察：部分瘤细胞的细胞核中可见断裂和浓聚的染色体，但核膜和细胞膜完整。

　　2.3　那法瑞林对移植瘤细胞DI及细胞增殖周期比例的影响　经CAS-20图像分析系统测定，那法瑞林治疗后移植瘤生长受到显著抑制的剂量组，其瘤组织细胞DI值与对照组相比，都有显著性下降(表3)。使用流式细胞术测定的结果为：那法瑞林1000及500μg/kg治疗组的瘤细胞增殖周期比例与对照组相比，S期细胞比例略有下降，但未出现显著性差异(表4)。

表2　那法瑞林或他莫昔芬接种后2周给药对移植瘤、卵巢及子宫质量和血清E₂水平的影响

　　Tab 2　Effect of nafarelin or tamoxifen administrated at 2 weeks after tumor inoculation on tumor,

　　ovarian, uterine mass and serum E₂ level of the mice with BCaP-37 breast tumor

(±s)

　　(m/mg)

　　(m/mg)

　　(c_B/pmol·L^－1)

^*P＜0.05, ^**P＜0.01 vs control group; ^a:n=9

表3　那法瑞林治疗对移植瘤DI值的影响

　　Tab 3　Changes of cell DNA index (DI) of BCaP-37 tumor in nude mice after nafarelin treatment

(±s)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control group；PⅠ： Administration after tumor inoculation；PⅡ： Administration at 2 weeks after inoculation； PⅢ：Nafarelin compared with D-Trp⁶LHRH

表4　那法瑞林治疗对移植瘤细胞增殖周期的影响

　　Tab 4　Changes of cell cycle distribution of BCaP-37 tumor in nude mice after nafarelin treatment

(±s)

　　1000μg/kg

PⅠ:Treated after inoculation；PⅡ：Treated at 2　 weeks after inoculation

　　3　讨　论

　　LHRH是下丘脑神经元中合成的由9种不同氨基酸组成的十肽，可选择性地刺激垂体前叶促性腺细胞释放黄体生成素和卵泡刺激素。该多肽在生理剂量下可作为激素的替代物，药理剂量下长期给药能引起下丘脑-垂体-性腺轴的抑制，产生可逆性的化学性性腺切除作用，人们利用这一特点进行抗生育和性激素依赖性疾病的治疗，其中就包括对乳腺癌的内分泌治疗。那法瑞林为一新的人工合成的LHRH高效类似物，它在LHRH结构的6位上引入了D-Nal(2) (D-naphthylalanine)，在10位用乙酰基替代，其活性达到天然LHRH的200倍^［1］。

　　目前临床上使用LHRH类似物治疗乳腺癌，主要是针对绝经期前的乳腺癌患者，其有效率可达31%～63%。对绝经期后的患者，虽然疗效稍差，但也可达到22%左右^［2］，显然，LHRH类似物的化学性性腺切除作用并不能解释对绝经后患者的疗效。我们曾研究过那法瑞林对体外培养的BCaP-37细胞的生长并无直接抑制作用，但能够拮抗雌激素对乳腺癌细胞的生长刺激作用^［3］。而对体内生长的BCaP-37乳腺癌移植瘤，那法瑞林却表现出了明显的生长抑制作用，而且早期用药的效果更为明显。从病理检查的结果来看，那法瑞林治疗组的瘤组织基本病理特征与对照组相比虽无明显变化，但在那法瑞林治疗后出现明显疗效的剂量组，瘤细胞中反映细胞增殖活跃程度的DI值显著下降；细胞增殖周期比例也显示：那法瑞林治疗组的S期(DNA合成期)细胞比例略有下降。这些结果提示移植瘤生长受抑的直接原因是瘤细胞的DNA合成受到了抑制。国外有文献报道，LHRH的另一类似物D-Trp⁶LHRH同样能够抑制人乳腺癌细胞的DNA合成^［4］。

　　尽管我们观察到在那法瑞林治疗组中，移植瘤生长明显受抑的动物，其卵巢质量和雌激素水平也明显降低，但性腺抑制、雌激素水平下降却并不是那法瑞林抑制肿瘤生长的原因。因为在同一组实验中，雌激素的拮抗剂他莫昔芬并未影响到BCaP-37移植瘤的生长。由此表明，BCaP-37移植瘤生长并非依赖于雌激素。那法瑞林抑制BCaP-37乳腺癌移植瘤生长的机制，并不是通过其化学性性腺切除作用即改变雌激素水平所达成，而很可能是直接通过LHRH受体或者通过该受体影响移植瘤其他的生长因子-受体系统而抑制瘤细胞DNA合成的^［5］。LHRH的另一类似物D-Trp⁶LHRH长期给药能够抑制非雌激素依赖的鼠乳腺癌MXT及非雌激素依赖的人乳腺癌MCF-7M Ⅲ裸鼠移植瘤的生长，其用药剂量为25μg/d^［6,7］。本实验中使用相近剂量的D-Trp⁶LHRH结果也表明，在移植瘤生长抑制作用强度上，D-Trp⁶LHRH与那法瑞林相比无差别。

　　作者单位：顾军　褚云宏　第二军医大学1989届硕士研究生，海军医学研究所潜水生理研究室，

　　上海，200433

　　周颖奇　海军第411医院神经内科

　　作者简介：顾军，男，1963年12月生，博士，副教授

　　参 考 文 献

　　[1]　Conn PM,Crowley WF Jr.Gonadotropin-releasing hormone and its analogues.N Engl J Med,1991,324(2):93

　　[2]　Burger CW,Prinssen HM,Kenemans P.LHRH agonist treatment of breast cancer and gynecological malignancies:a review.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,1996,67(1):27

　　[3]　周颖奇，顾军，褚云宏.促性腺激素释放激素类似物那法瑞林对人乳腺癌细胞BCaP-37生长的影响.第二军医大学学报，1999，20(2)：81

　　[4]　Brower ST,Schally AV,Redding TW,et al.Differential effects of LHRH and somatostatin analogs on human breast cancer.J Surg Res,1992,52(1):6

　　[5]　Milovanovic SR,Monje E,Szepeshazi K,et al.Effect of treatment with LHRH analogs containing cytotoxic radicals on the binding characteristics of receptors for luteinizing-hormone-releasing hormone in MXT mouse mammary carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol,1993,119(5):273

　　[6]　Szepeshazi K,Miloyanovic S,Lapis K,et al.Growth inhibition of estrogen independent MXT mouse mammary carcinomas in mice treated with an agonist or antagonist of LHRH,an analog of somatostatin,or a combination.Breast Cancer Res Treat，1992,21(3):181

　　[7]　Yano T,Korkut E,Pinski J,et al.Inhibition of growth of MCF-7 MⅢ human breast carcinoma in nude mice by treatment agonists or antagonists of LHRH.Breast Cancer Res Treat，1992,21(1):35