CyclinD1基因扩增及其蛋白表达在乳腺癌中的意义
中国普外基础与临床杂志 2000年第3期第7卷 基础与实验研究
作者：赵俊玲 杨金巧 赖毅
单位：华西医科大学附属第一医院普外科 成都 610041
关键词： 乳腺癌；CyclinD11基因；CyclinD1蛋白
【摘要】 目的 探讨乳腺癌中CyclinD1基因扩增和其蛋白表达的相关性及其临床意义。方法 应用半定量PCR和免疫组化技术，检测和分析了乳腺癌及其癌旁组织、乳腺良性组织及正常乳腺标本中CyclinD1基因的扩增和CyclinD1蛋白的表达情况。结果 62例乳腺癌中，CyclinD1基因扩增占22.6%(14/62)，蛋白过度表达占48.4%(30/62)，二者有一定相关性，而其它各种乳腺组织的CyclinD1基因扩增及蛋白过度表达与之相比差异有显著性意义(P＜0.05)。CyclinD1基因扩增及蛋白过度表达与乳腺癌组织学分级呈明显正相关，且CyclinD1蛋白过度表达还与雌孕激素受体状况呈正相关。结论 乳腺癌中CyclinD1基因扩增程度和其蛋白过度表达虽有一定相关性，但并不完全一致，说明还存在着其它导致CyclinD1蛋白过度表达的机理，CyclinD1蛋白的表达可能还受雌激素的调控。对乳腺癌中CyclinD1基因及其蛋白表达的检测有一定临床意义。
【中图分类号】 R737.9 【文献标识码】 A
【文章编号】 1007-9424(2000)03-0147-03
AMPLIFICATION OF CYCLIND1 GENE AND OVEREXPRESSION
OF ITS PROTEIN PRODUCT IN BREAST CANCER
ZHAO Jun-ling, YANG Jing-qiao, LAI Yi.
（ Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,
West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041）
【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of the amplification of CyclinD1 gene and overexpression of its protein product in breast cancer. Methods Semi-quantitative PCR and immunohistochemical techniques were used to examine the amplification of CyclinD1 gene and overexpression of its protein product in breast cancer, mammary tissues adjacent to the tumor, mammary benign disease and normal mammary tissues. Results The results showed that amplification of CyclinD1 gene was observed in 14 out of 62 (22.6%) breast cancer, the overexpression of its protein product was 48.4% (30/62). Compared with other mammary tissues, these findings were significant. Amplification of CyclinD1 gene and overexpression of its protein were positively associated with histological grade, and there was a strong correlation between CyclinD1 protein overexpression and estrogen receptor (progestogen receptor). Conclusion The degree of CyclinD1 protein overexpression is not quite the same as the frequency of the amplification of CyclinD1 gene. It suggests that the overexpresstion of CyclinD1 protein is also attributed to some other mechanisms. Estrogen might stimulate the expression of CyclinD1. The detection of CyclinD1 gene and its protein in breast cancer has some clinical significances.
【Key words】 Breast cancer CyclinD1 gene CyclinD1 protein▲
CyclinD1(周期素D1)基因是新近发现并确定的原癌基因，与许多肿瘤的发生发展、预后密切相关〔1〕。本研究采用半定量PCR及免疫组化法，分别检测乳腺癌中CyclinD1基因扩增及蛋白表达情况，结合临床资料，探讨CyclinD1在乳腺癌中的临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
62例乳腺癌标本来源于我院手术切除并由病理学检查证实的女性患者，年龄31～76岁，平均46.2岁，肿瘤病理类型包括浸润性导管癌57例，粘液腺癌、粉刺癌、乳突状腺癌各1例，原发浸润性小叶癌2例； 同时取相应癌旁组织共40例，并选同期病检证实的乳腺良性疾病标本24例，正常乳腺组织26例作为研究对照组。所有标本在手术切除后均于-80℃条件下保存待测。
1.2 实验材料
组织DNA提取、PCR及其产物电泳显色所需的试剂及仪器均由我校法医系物证实验室提供，免疫组化设备由我院病理科提供。CyclinD1基因引物对5′-ACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTG-3′(正义链)、5′-GACGGCAGGACCTCCTTCTGCACA-3′(反义链)及DRD2(多巴胺D2受体)基因引物对5′-TGATGATGATCTGGAGAGGCAGAAC-3′(正义链)、5′-TGCCGAAGACGATGACAGCGATGAG-3′(反义链)均购自生命技术公司。免疫组化一抗为鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，二抗为生物素化的羊抗鼠免疫球蛋白，三抗为链亲合素-酶标记物。二抗、三抗均购自美国Zymed公司。
1.3 实验方法
1.3.1半定量PCR 酚一氯仿法提取组织DNA。测定DNA纯度及含量并作相应稀释。PCR扩增总体积为20 μl，4种引物浓度各为10 μmol/L，Taq酶1.5 U，DNA 100 ng，10×buffer 2 μl，dNTP浓度200 μmol/L。反应条件为94℃预变性5分钟后进入循环，94℃变性1分钟→58℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，共30个循环。扩增产物经混有EB的2%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad公司的分子图像系统及IBM公司的分子分析程序测定各电泳带的强度(OD值)，计算CyclinD1/DRD2强度比率。
1.3.2免疫组化检测 LSAB(链亲合素生物素法)检测上述标本石蜡切片中CyclinD1蛋白的表达情况，设阳性对照片为食管癌，阴性对照片为PBS代替一抗。染色结果的判断采用McCarthy公式：
HSCORE＝∑(1＋i)Pi
i为从0～4 5个等级的染色强度，Pi为某种强度细胞所占的百分比，以HSCORE≥3为过度表达阳性。
1.4 统计学处理
实验数据用
±s表示，采用两样本均数t检验比较各乳腺组织中CyclinD1和DRD2基因PCR产物电泳带强度比率，其余数据均采用χ2检验。
2 结果
2.1 各乳腺组织中CyclinD1和DRD2 PCR产物电泳带强度比率
乳腺癌为2.15±0.33， 乳腺良性疾病为1.08±0.20， 癌旁组织为1.26±0.19， 正常乳腺组织为1.02±0.15， 其中乳腺癌的CyclinD1/DRD2比率与其它各组织相比差异均有显著性意义(P＜0.05)。 根据Kyomoto等〔2〕建议标准， 当比率大于2时判断为有扩增， 那么CyclinD1扩增情况为： 62例乳腺癌组织中14例有扩增， 占22.6%， 40例癌旁组织中也有3例显示CyclinD1基因扩增， 另外有1例囊性增生组织显示CyclinD1扩增， 正常组织中则无1例有扩增(见附图)。
2.2 各乳腺组织中CyclinD1蛋白过度表达情况
乳腺癌为48.4%(30/62)，乳腺良性疾病为12.5%(3/24)，癌旁组织为20.0%(8/40)，正常乳腺组织为3.8%(1/26)。前者与后3者比较，差异有显著性意义(χ2检验，P均＜0.005)。尽管在良性疾病及一些正常乳腺组织中也有CyclinD1蛋白表达，但其染色强度弱，阳性染色细胞散在分布，且以胞浆染色为主，未见明显核染色，而乳腺癌中绝大部分细胞表现为胞核染色，偶见胞浆着色。3例有基因扩增的癌旁组织均表现为蛋白过度表达。
附图CyclinD1和DRD2基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
1、正常乳腺组织； 2、癌旁组织； 3、4均为乳腺癌组织，其中2、4显示CyclinD1基因扩增
2.3 乳腺癌组织中CyclinD1基因扩增与蛋白表达关系
结果见表1。经χ2检验，二者有明显的相关性，相关程度为67.7%。
表1 乳腺癌组织中CyclinD1基因扩增与蛋白表达的关系
| |
CyclinD1蛋白过度表达 |
合计 |
| (+) |
(-) |
| 基因扩增(+) |
12 |
2 |
14 |
| 基因扩增(-) |
18 |
30 |
48 |
| 合计 |
30 |
32 |
62 |
2.4 乳腺癌中CyclinD1基因扩增及蛋白表达与临床病理特征的关系
结果见表2。由表2可见，CyclinD1基因扩增及其蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、腋淋巴结状况、临床分期以及DNA倍体状况无明显相关性，但与肿瘤组织学分级呈明显正相关关系； CyclinD1蛋白表达与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)状况也有一定的关系，CyclinD1在ER和PR阳性的肿瘤中表达较高。
表2 乳腺癌组织中CyclinD1基因扩增及蛋白表达与临床病理特征的关系
| 病床病理特征 |
例数(＝62) |
基因扩增 |
P |
蛋白过度表达 |
P |
| 年龄≤39岁 |
6 |
1 |
＞0.05 |
3 |
＞0.05 |
| 40～49岁 |
37 |
8 |
16 |
| ≥50岁 |
19 |
5 |
11 |
| 肿瘤≤3cm |
34 |
7 |
＞0.05 |
16 |
＞0.1 |
| ＞3cm |
28 |
7 |
14 |
| 腋淋巴结(-) |
39 |
9 |
＞0.2 |
19 |
＞0.2 |
| 腋淋巴结(+) |
23 |
5 |
11 |
| 临床Ⅰ/Ⅱ |
41 |
10 |
＞0.05 |
20 |
＞0.2 |
| 临床Ⅲ/Ⅳ |
21 |
4 |
10 |
| 组织学分级 |
| Ⅰ/Ⅱ级 |
33 |
4 |
＜0.05 |
11 |
＜0.025 |
| Ⅲ级 |
27 |
9 |
17 |
| ER(+) |
40 |
8 |
＞0.05 |
24 |
＜0.025 |
| ER(-) |
22 |
6 |
6 |
| PR(+) |
35 |
6 |
＞0.05 |
21 |
＜0.05 |
| PR(-) |
27 |
8 |
9 |
| DNA倍体 |
| 二倍体 |
36 |
7 |
＞0.05 |
17 |
＞0.1 |
| 异倍体 |
26 |
7 |
13 |
不包括2例不宜用Nottingham分级的小叶癌
3 讨论
CyclinD1是细胞增殖周期从G1期到S期的关键蛋白，它通过与CDK4结合，调节Rb蛋白的磷酸化状态，从而调控细胞的增殖状态，它被确定为原癌基因是源于对它在甲状腺癌中过度表达的研究〔1〕。其后发现CyclinD1与许多肿瘤密切相关。转基因小鼠的研究支持CyclinD1直接参与肿瘤发生，研究显示其在乳腺上皮细胞的过度表达导致乳腺增生，最终形成肿瘤； 而纯合缺失CyclinD1的小鼠表现在胚胎形成期乳腺小叶发育明显缺陷，这表明CyclinD1在乳腺组织生长发育过程中有不可替代的关键作用〔3〕。CyclinD1在肿瘤发生中有多种变异形式： 基因扩增、染色体倒位、转位等，基因扩增最为常见，食管癌、头颈部鳞癌、乳腺癌等均有研究报道CyclinD1基因扩增〔2〕。Michalides等〔4〕在原发乳腺癌中检测到CyclinD1有15%～20%的基因扩增。CyclinD1基因扩增与蛋白表达在许多肿瘤中具有一致性，但在乳腺癌中例外。Paul等〔5〕报道乳腺癌中CyclinD1蛋白有59%的过度表达，Zhang等〔6〕的研究结果更高，达81.3%。因此，乳腺癌中CyclinD1蛋白的检测可协助乳腺癌的诊断。
本研究用半定量PCR及免疫组化法分别检测各乳腺组织中CyclinD1基因扩增及蛋白过度表达情况，结果62例乳腺癌中14例有基因扩增(22.6%)，30例有CyclinD1蛋白过度表达(占48.4%)。癌旁组织也有3例显示CyclinD1基因扩增，相应标本的蛋白表达强阳性，而良性肿瘤标本和正常乳腺组织几乎未见明显基因扩增，蛋白表达也仅为弱阳性或阴性。尽管基因扩增和蛋白表达的程度不完全一致，但仍有统计学意义上的相关性，相关程度为67.7%，而其不完全一致性提示可能存在除基因扩增外的其它蛋白表达机理。在人乳腺癌细胞系中发现一种编码1.1～1.3 kb的mRNA，其半衰期延长，由于缺失3′端非翻译区，较正常的4.2 kb转录子稳定，这种截形CyclinD1基因可导致CyclinD1蛋白过度表达〔7〕。Surmacz等〔8〕研究表明，用血清或血小板衍生生长因子可刺激纤维母细胞CyclinD1 mRNA水平的一过性增高，但并未观察到相应的基因扩增现象。Furlanetto等〔9〕观察到胰岛素样生长因子也可刺激CyclinD1的转录和表达，促进细胞分裂增殖。另外，CyclinD1的表达还可能与雌激素的调控有关〔4〕。因此，CyclinD1蛋白过度表达的机理并未完全阐明，尚需进一步深入研究。
结合临床资料的研究表明，CyclinD1基因扩增及蛋白过度表达与患者年龄、肿瘤大小、腋淋巴结状况、临床分期及DNA倍体状况无明显的相关性，但与肿瘤组织学分级呈明显正相关。由于肿瘤组织学分级越高，细胞分化程度越差，增殖明显活跃，CyclinD1在组织学分级越高的肿瘤中过度表达进一步证明了其促增殖的正性作用。
CyclinD1蛋白表达与ER、PR状况也有一定关系。CyclinD1在ER、PR阳性的肿瘤中表达较高，Michalides等〔4〕对这一现象的解释是，ER阳性的乳腺癌中，CyclinD1基因受雌激素调控可产生CyclinD1蛋白的过度表达。另外，由于CyclinD1和雌激素在促细胞生长增殖及促肿瘤发生发展方面的一致性作用，且二者的作用和生长因子等都有一定的关系，也许可以部分解释CyclinD1和ER表达的一致性。
总之，细胞周期的调控是多层次的相互制约的复杂事件，参与调控的因素很多，CyclinD1作为G1/S期关键作用的调节因子，起着促进细胞增殖的正性作用，它以多种变异形式参与肿瘤的发生发展，随着分子生物学等技术的进步，对CyclinD1基因蛋白结构、功能、作用机理、临床意义的研究也将进一步深入。
本文承蒙法医学系陈国弟教授、辛军平讲师及分子生物学实验室覃扬副教授、病理科张尚福教授的指导和帮助，特此致谢!■
【作者简介】 赵俊玲(1972年-)，女，四川省盐亭县人，医学博士，主研方向为乳腺癌。
参考文献
［1］Kamb A, Gruis NA, Weaver FT, et al. A cell cycle regulator potentially in genesis of many tumor types 〔J〕. Science, 1994; 264(2)∶436
［2］Kyomoto R, Kumazwa H, Toda Y, et al. CyclinD1-gene amplification is a more potent prognostic factor than its protein over-expression in human head-and-neck squamous-cell carcinoma 〔J〕. Int J Cancer, 1997; 74(2)∶576
［3］Bartkova J, Lukas J, Müller H, et al. CyclinD1 protein expression and function in human breast cancer 〔J〕. Int J Cancer, 199 4; 57(1)∶353
［4］Michalides R, Hageman P, Tinteren H, et al. A clini copathological study on overexpression of CyclinD1 and of p53 in a series of 2 48 patients with operable breast cancer 〔J〕. Br J Cancer, 1996; 73(2)∶728
［5］Paul J, Michalides R, Jannink I, et al. CyclinD1 expression in invasive breast cancer 〔J〕. Am J Pathology, 1997; 150(2)∶705
［6］Zhang SY, Caamano J, Cooper F, et al. Immunohistoch emistry of CyclinD1 in human breast cancer 〔J〕. Am J Clin Pathol, 1994; 102 (2)∶695
［7］沈 凯， 唐孝达， 杨宇如. D类细胞周期素与癌基因和抑癌基 因 〔J〕. 中华医学遗传学杂志， 1996； 13(6)∶361
［8］Surmacz E, Reiss K, Sell C, et al. CyclinD1 messe nger RNA is inducible by platelet-derived growth factor in culture fibroblasts 〔J〕. Cancer Res, 1992; 52(19)∶4522
［9］Furlanetto RW, Harwell SE, Firck KK. Insulinlike growth factor-1 induces CyclinD1 expression in MG 63 human osteosarcoma cell in vit ro 〔J〕. Mol Endocrinol, 1994; 8(2)∶510
［10］Surmacz E, Marina A, Mary K, et al. Type I insulin-like growt h factor receptor function in breast cancer 〔J〕. Breast Cancer Research and T reatment, 1998; 47(1)∶255
收稿日期：1999-08-28
修稿日期：2000-02-23
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