乳腺癌组织中孕激素受体与雌激素受体DNA结合功能关系的研究^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第10期

杨红斌　付京　张盈华　郝新保　邱福海　张利朝

　　　摘　要　目的：观察36例(E₂＋)乳腺癌患者组织PR和ERDNA结合功能的关系，进而探讨(E₂＋/PR＋)表型内分泌治疗无反应的分子机制。方法：用激素结合法和迁移率改变法。结果：1)用含有ER的MCF－7细胞株作为阳性对照，22℃Mg²＋存在条件下，迁移率改变法中ER－ERE复合物的形成是激素依赖性的，证实了ER－ERE复合物的特性。2)激素结合法和迁移率改变法检测结果显示，36例(E₂＋)乳腺癌中有25例相一致，其中两种方法都是阳性者(PR＋/ERE＋)17例，都是阴性者(PR－/ERE－)8例。3例肿瘤，激素结合法阳性而迁移率改变法阴性（PR+/ERE-）。 8例肿瘤，激素结合法阴性而迁移率改变法阳性(PR－/ERE＋)。结论：乳腺癌组织中依赖ER的PR表达还有其它途径(PR＋/ERE－)，且PR阴性不能表示ERDNA结合功能状态有缺陷(PR－/ERE＋)，利用PR评估ERDNA结合功能状态以指导乳腺癌的内分泌治疗存在约30％(11/36)的误差率。因此，传统的激素结合法检测结果(E₂、PR)同迁移率改变法检测结果(ERE)相结合，能更准确地反应ER功能状态，为临床术后内分泌辅助治疗乳腺癌提供更可靠的依据。

　　　关键词：乳腺癌　孕激素受体　雌激素受体　DNA结合结构域　迁移率改变法

　　乳腺癌患者癌细胞中雌激素受体(estrogen receptor，ER)功能状态的检测对选择治疗方案、估计预后具有重要指导意义^[1,2]。ER的激素结合法(E₂)检测能准确反映ER激素结合结构域(hormone binding domain，HBD)的功能活性，孕激素受体(progesterone receptor，PR)的检测能间接评估ERDNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)的功能状态^[3,4]。尽管应用激素结合法测定指标E₂和PR来反映乳腺癌组织中ER的功能状态大大提高了内分泌治疗乳腺癌的应答率，但仍有大约1/3E₂和PR同时阳性(E₂＋/PR＋)患者对内分泌治疗无反应^[5]。关于(E₂＋/PR＋)表型无反应的分子机制还不清楚。本文作者对筛选的36例(E₂＋)乳腺癌组织标本，应用迁移率改变法直接测定了ERDBD的功能活性，并同PR激素结合法测定结果比较，旨在了解PR与ERDBD功能状态的关系，进而探讨(E₂＋/PR＋)表型内分泌治疗无反应的分子机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞株和组织标本

　　含有ER的乳腺癌细胞株MCF－7购自美国ATCC(American Tissue Culture Collection)。36例乳腺癌组织标本(由本院普外科提供)均经病理诊断为原发性乳腺癌，经激素结合法筛选为E₂＋者测定其PR，剩余组织在液氮罐中研磨成粉备用。

　　1.2　主要试剂

　　1)酶联孕激素衍生物(P－HRP)亲和组化法药盒上海医科大学肿瘤医院肿瘤研究所提供。2)[γ－³²P]ATP(10μCi/μl)购自北京亚辉生物医学工程公司。3)T₄多核苷酸激酶(10U/μl为Promega公司产品。4)monothioglycerol、leupeptin和鲑精DNA购自Sigma公司。5)雌激素应答元件(estrogen response element，ERE)双链探针根据^[6,7]已发表的爪蟾卵黄蛋白原A2(Xenopus vitellogenin A2)基因中ERE结构，设计两条寡核苷酸链由上海生物医学工程公司合成，序列为5′－CGAGGTCACTGTGACCT－3′和5′－CGAGGTCACAGTGACCT－3′。等摩尔的两条链加入TE缓冲液(10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH8.0)中，混匀，加热至95℃，退火，1小时内冷却至室温。

　　1.3　蛋白抽提液制备

　　MCF－7细胞采用150ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养，待细胞生长至对数期，收集细胞。参照Dignam等的报道^[8]制备核抽提液。获得的透析上清液含有3mg/ml蛋白，－70℃贮存备用。

　　乳腺癌标本每例取500mg组织粉加入1ml冰冷抽提缓冲液(0.4mol/LKCl，10mmol/LTrispH7.4，2mmol/LPMSF，1mmol/LEDTA，10mmol/Lmonothioglycerol，100ml/L甘油)，混匀，4℃16000r/分离心30分钟取上清液4℃132000g离心30分钟。吸弃上清液表面的薄层脂膜，测定上清液中蛋白浓度(Lowry－Folin酚法)，－70℃贮存备用。

　　1.4　ERE探针标记

　　合成的ERE双链(20pmol/μl)1μl，10×T₄多核苷酸激酶缓冲液2μl，[γ－³²P]ATP10μl，T₄多核苷酸激酶1μl，鲑精DNA(10mg/ml)1μl，双蒸水5μl，以上各成分混匀，37℃反应1小时，72℃加热灭活20分钟。

　　1.5　激素结合法

　　经筛选E₂＋的乳腺癌标本，经10％甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4μm，脱蜡至水，1％H2O2孵育30分钟，PBS洗涤，pH6.0柠檬酸盐缓冲液热修复，5％山羊血清孵育30分钟滴加P－HRP50μl放置湿盒，4℃过夜。取出PBS洗涤后，DAB显色10分钟，苏木素复合染色，显微镜下观察结果。

　　1.6　迁移率改变法[9,10]

　　取10μl蛋白抽提液(约4mg/ml)与30μl孵育缓冲液(100mmol/LTris，pH8.0，2mmol/L leupeptin，1mmol/L EDTA，10^－8mol/L E₂，100ml/L甘油)混匀，0℃放置20分钟，加入1000fmol[γ－³²P]－ERE，22℃孵育20分钟。用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行放射性自显影。

　　2　结果

　　2.1　PR结果判断

　　1)PR－：阳性癌细胞＜20％，间质无黄色，细胞内无棕黄色阳性颗粒或呈均一淡棕黄色颗粒与背景一致而无区别。2)PR＋：阳性细胞数≥20％，间质有淡、较深、深黄染色，细胞核或浆内见棕黄色颗粒明显高于背景着色，见图1。

图1　乳腺癌PR亲和组化阳性表达×200

　　2.2　ERE阳性判断标准

　　在迁移率改变法中，用含有ER的乳腺癌细胞株MCF－7作为ERE结合力的阳性对照，凡测定标本在MCF－7道同一水平平行S处有ER－ERE复合物带为ERE＋，反之为ERE－，见图2。

1为阳性对照MCF－7道，2、4为乳腺癌标本(ERE＋)道，

　　3为乳腺癌标本(ERE－)道

　　s：ER－ERE复合物带F：游离[γ－³²P]－ERE探针图2在MCF－7细胞和乳腺癌组织抽提液中ERE特异地与ER相结合

　　2.3　ER－ERE复合物鉴定

　　22℃Mg^2＋存在情况下，ER－ERE复合物的形成受雌激素的影响。孵育混合物中不加入雌激素与加入雌激素相比，ER－ERE复合物带显著减少，见图3。

E₂：雌激素S：ER－ERE复合物带F：游离[γ－³²P]－ERE探针图3在22℃Mg^2＋(5mmol/L)存在条件下ER－ERE复合物形成的激素依赖作用

　　2.4　迁移率改变法和激素结合法结果比较

　　36例(E₂＋)的乳腺癌患者标本经迁移率改变法和激素结合法测定其ERE和PR，分为4种表型见图4。测定结果36例中有25例相一致，其中两种方法都是阳性者(PR＋/ERE＋)17例，都是阴性者(PR－/ERE－)8例。3例肿瘤，激素结合法阳性而迁移率改变法阴性(PR＋/ERE－)。8例肿瘤，激素结合法阴性而迁移率改变法阳性(PR－/ERE＋)。

括号外的数字表示肿瘤的例数，括号内数字代表百分数图4(E₂＋)的乳腺癌ER表型分类

　　3　讨论

　　自从70年代初，Jensen发现ER以来，ER的功能状态与乳腺癌内分泌治疗关系的研究不断地有突破性进展。1974年在美国Bethesda国际会议上综合了世界上各国400多份各种方式的激素治疗报告，表明未经激素受体测定的乳腺癌病例应用内分泌治疗的有效率只有30％；而ER测定阳性患者(E₂＋)内分泌治疗有效率达50％～60％，受体阴性患者(E₂－)只有5％～8％。以上ER的测定只能反映ERHBD功能活性，为了完整地反映ER的功能状态，1978年Horwitz等报道^[3]，PR是雌激素诱导的产物，通过测定乳腺癌组织中PR能间接地评估ERDBD功能活性。1985年McGuire等研究显示^[11]，应用激素结合法同时测定乳腺癌组织中ER和PR，E₂＋/PR＋者内分泌治疗有效率几乎达80％，E₂＋/PR－也有40％应答率。尽管如此，对E₂＋/PR＋或/PR－乳腺癌表型内分泌治疗无应答或有应答这一现象的分子机制还不清楚。1991年，Foster等^[10]根据ER能特异地与它的应答元件(ERE)相结合的原理，首次报道应用迁移率改变法直接检测人乳腺癌组织中ERDBD的功能活性，为研究E₂＋/PR＋或E₂＋/PR－乳腺癌表型内分泌治疗无应答或有应答的分子机制提供了一个强有力的手段。

　　本实验从1997年5月至1998年10月，应用ER激素结合法筛选了36例(E₂＋)原发性乳腺癌患者组织标本，通过迁移率改变法直接检测ERDBD的功能活性，并与PR激素结合法检测结果相比较。结果显示，36例(E₂＋)乳腺癌标本，两种方法测定25例相一致，其中PR＋/ERE＋17例，PR－/ERE－8例，一致率为70％(25/36)，说明大部分乳腺癌中PR测定结果能够反映ERDBD的功能活性。20例PR＋中，17例ERE＋，3例ERE－，表明应用PR评估ERDBD功能状态有一定的误差率。3例PR＋/ERE－还表明，尽管ER的DNA结合功能状态有缺陷，PR却仍能表达，说明PR基因通过雌激素诱导表达不是唯一途径，Fuqua等人也有此类表型的报道^[12]。16例PR－中有8例ERE＋，表明PR基因本身存在缺陷或者未测定的ER其它结合结构域发生突变，也支持应用PR反映ERDBD功能状态存在一定误差的观点，并且从另一个侧面阐明了McGuire等报道E₂＋/PR－表型患者内分泌治疗有40％应答率的现象。

　　为了保证迁移率改变法中实验结果的可靠性，根据在Mg^2＋存在下ER－ERE复合物的形成是激素依赖性的原理，我们进行了鉴定实验(见图3)，发现在激素不存在情况下ER－ERE复合物带的密度显著减少，与文献[10]报道相符合。

　　综上所述，传统的ER功能状态测定指标E₂和PR，在反映ER功能状态方面有一定的误差率，尤其是PR在间接评估ER的DNA结合功能方面。我们的实验结果显示，36例(E₂＋)乳腺癌中PR和ERE约有30％(11/36)不一致率，这必将延误临床乳腺癌患者治疗方案的正确选择和治疗效果，导致患者无瘤生存期和总生存期的缩短。因此，应用迁移率改变法直接测定ER的DNA结合功能同传统的激素结合法测定指标(E₂、PR)相结合，一定程度上揭示了乳腺癌激素治疗耐药的机理，而且两种方法联合应用，能更精确地反映ER的功能状态，对进一步改进乳腺癌的内分泌治疗具有重大的临床意义。

　　＊本文课题受国家自然科学基金资助(39380006)

　　作者单位：杨红斌　张盈华　郝新保　张利朝　第四军医大学唐都医院中心实验室(西安市710038)

　　付 京　邱福海　普外科

参考文献

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　　7 Kumar V,Chambbon P. The estrogen receptor binds tightly to its responsive element as a ligand－ induced homodimer. Cell,1988;55:145

　　8 Dignam JD,Lebovitz RM,Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase Ⅱ in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res,1983;11:1475

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　　10 Foster BD,Cavener DR,Parl FF. Binding analysis of the estrogen receptor to its specific DNA target site in human breast cancer. Cancer Res,1991;51:3405

　　11 McGuire WL,Clark GM. Role of progesterone receptors in breast cancers. Semin Oncol,1985;12(Suppl 1):12

　　12 Fuqua SAW,Fitzgerald SS,Chamness GC,et al. Variant human breast tumor estrogen receptor with constitutive transcriptional activity. Cancer Res,1991;51:105