乳腺癌中nm23-H1 mRNA及其蛋白低表达的研究

中华医学遗传学杂志 2000年第2期第17卷 论著

作者：郭文斌　王燕霞　庄熙晶　白艳　张嘉庆

单位：郭文斌（116033 辽宁省大连市中心医院 普外2科）；王燕霞（116033 辽宁省大连市中心医院 普外2科）；庄熙晶（116033 辽宁省大连市中心医院 普外2科）；白艳（116033 辽宁省大连市中心医院 普外2科）；张嘉庆（北京医科大学人民医院）

关键词：乳腺肿瘤；nm23基因；基因表达

　　【摘要】　目的　探讨nm23-H1 mRNA及其蛋白低表达之间相关性及与乳腺癌生物学行为的关系。方法　应用RT/PCR及免疫组化方法对58例乳腺癌组织中nm23-H1 mRNA及其蛋白的表达进行检测。结果　分别有44.8%、48.2%的乳腺癌伴有nm23-H1 mRNA或该基因编码蛋白的低表达，nm23-H1 mRNA与其蛋白表达虽有相关性，但并不完全吻合。低水平的nm23-H1 mRNA或其蛋白质表达与乳腺癌淋巴转移呈显著关系。结论　通过nm23-H1表达水平的检测对乳腺癌的转移潜能及预后有一定的意义。

Low expression of nm23-H1 mRNA and its protein in breast cancer

GUO WenbinWANG YanxiaZHUANG XijingBAI Yan

　　(Department of General Surgery,Dalian Central Hospital, Dalian,Liaoning, 116033 P.R.China.E-mail:zhuangxijing@hotmail.com)

　　ZHANG Jiaqing

　　(The People's Hospital of Beijing Medical University 100044 P.R.China)

　　【Abstract】　Objective　To explore the expression of nm23-H1 mRNA and its protein in breast cancer and its correlation to the biologic behavior.Methods　RT-PCR and immunohistochemical method were employed to detect the expression of nm23-H1 mRNA and its protein in 58 breast cancer tissues. Results　Low level expression of nm23-H1 mRNA and protein was shown in 44.8% and 48.2% of examinated cases respectively. The low expression of nm23-H1 mRNA was correlated, but not always parallel to the protein expression. The low level expression of nm23-H1 mRNA or the protein was significantly associated with lymphatic metastasis of the cancer.Conclusion　Examination of nm23-H1 expression may be of significance in evaluating metastatic potentiality and prognosis of breast cancer.

　　【Key words】　breast carcinoma;　nm23-H1 gene;　gene expression

　　nm23-H1是新近发现的一种重要的肿瘤转移抑基因^［1，2］，研究表明其在多种肿瘤中表达异常与肿瘤的转移潜能密切相关。有关乳腺癌中nm23-H1 mRNA或其蛋白表达异常已有报道^［3，4］。但对二者同步检测报道尚少。且在该基因mRNA水平检测多采用Northern或斑点杂交法，存在周期长、同位素污染的问题，因此不适用于常规标本的研究。我们应用逆转录PCR(RT/PCR)定量法快速检测58例乳腺癌组织中nm23-H1 mRNA表达，同时利用免疫组化技术测定其蛋白表达，以了解乳腺癌中nm23-H1 mRNA及其蛋白低表达的特点，探讨该基因mRNA与蛋白表达的关系及乳腺癌生物学行为的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料来源　取自于北京医科大学人民医院手术切除的58例原发性乳腺癌新鲜组织，以正常腺体作为对照，诊断均经病理证实。

　　1.2　总RNA提取及RT-PCR定量分析　提取组织中的总RNA。RT-PCR按改良Nooman方法进行，以β-微球蛋白(β-MG)作为内参照。nm23-H1引物(a:5′-TTGAGCGTACCTCCATTACE-3′;b:5′-TTTGCA-CTCTCCACAGAATC-3′);β-MG引物(a:5′-ACCC-CCACTGAAAAAGATGA-3′;b:5′-ATCTTCAAA-CCTCCATAGTA-3′)在25 μl反应体系中进行PCR扩增^［5］。条件为预变性：94℃5 min。循环条件为94℃60 s，72℃60 s，共32个周期。取10 μl反应液电泳，溴乙锭染色，观察并摄片。

　　1.3　吸光度A扫描分析　摄影负片用光密度仪(Beckman CDS-200)进行电泳道的纵向扫描。可直接读出各峰面积的积分相对值。鉴于各峰均为近似三角形。因此，可用求三角形面积的方法计算相对吸光度A(旧称光密度OD)值。根据每一泳道内各区带对光的吸收，求nm23-H1与β-MG带的比值，以确定nm23-H1表达水平。

　　1.4　免疫组化染色　新鲜标本常规福尔马林固定，24 h后取材，石腊包埋，连续5 μm切片。nm23-H1单抗由Oncogene Science公司提供，ABC复合物购于DAKO公司。免疫组化染色程序按说明书进行。

　　1.5　结果判断　(1)nm23-H1 mRNA表达阳性标准：在乳腺正常腺体中nm23-H1 mRNA均为低表达，故取20例乳腺正常腺体作为对照，其nm23-H1/β-MG比值为0.82±0.12。其双侧99%可信区间0.51～1.13，即检测病例nm23-H1/β-MG大于1.13者为无表达水平下降，否则为低表达，即为阳性病例^［6］。(2)nm23-H1蛋白表达阳性标准：nm23阳性染色为位于细胞浆的棕黄色颗粒，当乳腺癌细胞着色极浅或阳性染色的乳腺癌细胞＜30%时为低表达，即阳性病例；≥31%时为无表达水平下降^［7］。

　　1.6　统计学处理　数据结果的统计和分析采用卡方检验。

　　2　结果

　　2.1　乳癌组织中nm23-H1 mRNA或其蛋白低表达与临床参数的关系　在58例乳腺癌中nm23-H1 mRNA及其蛋白低表达率分别为44.8%(26/58)及48.2%(28/58)；其中在淋巴结转移组中，nm23-H1 mRNA或其蛋白低表达率(69.2%；70.3%)明显高于非转移组(29.0%；29.0%)(P＜0.01，P＜0.01)，而二者的表达与其它临床预后参数的关系尚不显著(表1、图1～4)。

表1　58例乳腺癌中nm23-H1mRNA或其蛋白低表达与临床因素分析

　　Table 1 nm23-H1 mRNA or its protein low expression in 58 breast cancers compared with clinical parameters

　　LE:low expression；ER:estrogen receptor(雌激素受体)

图1　利用RT-PCR法检测nm23-H1 mRNA表达结果　β-MG参照基因120bp,nm23-H1目的基因366bp;M:PBR322/HaeⅢ标志物；1:正常乳腺组织nm23-H1带；2、3：肿瘤高表达(亮度较强)；4、5：肿瘤低表达(亮度较弱)　图2　乳腺正常组织中nm23-H1蛋白表达结果　在乳腺组织细胞浆中未见nm23-H1蛋白着色，ABC法×400　图3　乳腺癌中nm23-H1蛋白低表达结果　在乳腺癌组织细胞浆中未见nm23-H1蛋白着色，ABC法×400　图4　乳腺癌中nm23-H1蛋白高表达结果　在乳腺癌组织细胞浆中见nm23-H1蛋白着色，ABC法×400

　　Fig1 Analysis of nm23-H1 gene mRNA expression in human breast carcinomas by RT-PCR Primers used for the RT-PCR were for the β-MG (120bp,control) and nm23-H1(366bp) expression. Lane M:PBR 322/HaeⅢ； lane 1:Normal breast tissue nm23-H1;lanes 2,3 (tumors,patients 6,8):stronger(high expression);lanes 4,5(tumors,patients 9,12):lighter(low expression) Fig 2 Expression of nm23-H1 protein in normal breast tissue Staining of nm23-H1 protein was not observed in cytoplasm of normal breast tissue,ABC method×400 Fig 3 Low expression of nm23-H1 protein in breast cancer Staining of nm23-H1 protein was not observed in cytoplasm of breast cancer,ABC method×400 Fig 4　Over expression of nm23-H1 protein was observed in cytoplasm of breast cancer cells,ABC method×400

　　2.2　相关分析　在26例具有nm23-H1 mRNA低表达者，有20例伴该基因编码蛋白的低表达，nm23-H1 mRNA与其蛋白表达呈显著相关(P＜0.01，r=0.64)。但nm23-H1 mRNA低表达并不完全导致其蛋白产物降低，蛋白的低表达并不一定由其mRNA水平下降所致。在本研究中，3例nm23-H1 mRNA低表达，未见其蛋白水平下降；而6例nm23-H1蛋白呈阴性反应者，并未见其水平下降。

　　3　讨论

　　nm23-H1表达水平与肿瘤转移密切相关，而且多数学者都试图将其基因的表达异常与患者的临床指标作相关分析，以探讨是否nm23-H1表达异常可作为判断预后新的指标^［6］。

　　在研究中，我们应用RT/PCR(定量法)，且通过加入内参照引物使结果准确可靠。利用PCR技术将目的基因扩增几十万倍，使其灵敏度远远高于Northern及斑点杂交，并兼有简单、快速、无放射性污染之优点。本结果提示乳腺癌中nm23-H1 mRNA及其蛋白的低表达率分别为44.8%、48.2%，二者虽显著相关，但并不完全吻合，说明nm23-H1 mRNA低表达并不一定能导致蛋白产物下降，而蛋白产物的表达下降也不完全由其mRNA低表达引起，因此，存在其它未知因素参与该基因翻译的调控。在临床的相关研究中发现低水平的nm23-H1 mRNA或其蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关，而该因素正是反映肿瘤沿淋巴道转移的潜能，因此提示，具有nm23-H1低表达的乳腺癌具有更强的转移能力，预后较差。我们分别应用RT-PCR定量及免疫组化方法对乳癌组织中nm23-H1表达水平进行了研究，使临床工作者不但能从常规病理切片观察肿瘤的形态学改变，而且可在分子及细胞水平上，了解该基因表达变化，同时可将3个水平的改变对照分析，因此该方法在临床工作中有应用的潜能，并为寻找某些新的预后指标提供了一种新的方法。

　　注：本研究在北京医科大学人民医院完成

　　参考文献

　　［1］Hennessy C,Henry JA,May EB,et al.Expression of the antimetastatic gene nm23 in human breast cancer:an association with good prognosis.J Natl Cancer Inst,1991,83∶281-285.

　　［2］Haut M,Steen PS,Willson KV,et al.Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasma and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1991,83∶712-716.

　　［3］Leone A,Flatow V,King CR,et al.Reduced tumor incidence,metastatic potential,and cytokine responsiveness of nm23 transfected melanoma cell.Cell,1991,65∶25-35.

　　［4］Slamon DJ.Expression of the nm23 gene and breast cancer prognosis. J Natl Cancer Inst,1991,83∶229-231.

　　［5］Mandai M,Konishi I,Koshiyama M,et al.Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm-23-H2 gene in ovarian carcinomas;correlation with clinicopathology,EGFR,c-erbB₂ and c-erB₃ gene,and sex steroid receptor expression.Cancer Res,1994,54∶1825-1830.

　　［6］ToKunaya V,Urano T,Furukawa K,et al.Reduced expression of nm23-H1 but not of nm23-H2,is concordant with the frequency of 1ymph-node metastasis of human breast cancer.Int J Cancer,1993,55∶66-71.

收稿日期：1999-04-29