膀胱肿瘤细胞凋亡及其对预后的影响

癌症 2000年第5期第19卷 临床研究

作者：秦自科　梅骅　戴宇平　王晓波

单位：秦自科　梅骅　戴宇平　王晓波（中山医科大学附属第一医院泌尿外科,广东　广州510080）

关键词：膀胱肿瘤；凋亡；诊断；预后

　　【摘要】目的：探讨细胞凋亡与膀胱癌临床生物学行为的关系。方法：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记法（TUNEL）进行膀胱癌细胞凋亡的检测。结果：49例膀胱癌标本共有43例（87.76％）发生细胞凋亡，细胞凋亡指数为(45.66±12.49)％，细胞凋亡指数大小与病人年龄、性别、肿瘤大小、数目无关（P＞0.05），与肿瘤分级、分期呈负相关（P＜0.01），即肿瘤“瘤级”和“瘤期”越高，则细胞凋亡越少，易复发肿瘤其细胞凋亡指数明显小于不复发肿瘤（P＜0.05）。结论：膀胱癌细胞凋亡与肿瘤分级、分期及预后有关。膀胱癌细胞凋亡减少提示肿瘤分化差、易浸润，且病人预后较差。

　　中图分类号：R737.140文献标识码：A文章编号：1000－467X（2000）05－0476－03

Cellular apoptosis and its influence on prognosis of bladder cancer

QIN Zi-Ke, MEI Hua, DAI Yu-Ping, et al.

　　(Department of urology, the first hospital of Sun Yat-sen university of medical sciences,Guangzhou 510080， P.R.China)

　　【Abstract】 Objective： To explore the relationship between cellular apoptosis and clinicbilogical acting for bladder cancers. Methods： The cellular apoptosis of bladder cancers were detected by TUNEL (terminal deoxynucleotidyl-transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling) assay in 49 cases. Results： Cellular apoptosis exhibited in 46 (87.76％ ) cases and the apoptosis index (AI) was (45.66± 12.49)％ (± s) for 49 cases of bladder cancers. The “ AI” of bladder cancer was not related with patient-s age, sex, size or number of the tumor (P ＞0.05), but it was related with “ grade” and “ stage” of the tumor (P＜0.01), specifically the higher “ grade” or “ stage” the less cellular apoptosis. The “ AI” in easily recurrent bladder tumors were less than that of primary bladder tumors (P＜ 0.05). Conclusions： The “ AI” of bladder cancer is related with the “ grade” , “ stage” and prognosis of the tumor. A reduced “ AI” in bladder cancer indicates a worse differentiated or/and advanced tumor and the detection of cellular apoptosis of bladder cancer is helpful for evaluating the prognosis of the patient.

　　Key words： Bladder neoplasms; Apoptosis; Diagnosis; Prognosis

　　细胞凋亡（Apoptosis）的概念最早由英国生物学家Kerr等^[1]于1972年首先提出。细胞凋亡的主要作用是清除机体内衰老或变异的细胞，维持机体正常的结构和功能。细胞凋亡的异常与肿瘤的发生发展密切相关。本研究通过检测分析膀胱癌细胞凋亡规律，探讨细胞凋亡对膀胱癌的诊断及防治的临床指导意义。

　　1资料和方法

　　1.1标本来源

　　自1997年6月至1998年5月，49例膀胱肿瘤患者在我院住院接受手术治疗。其中41例行保留膀胱的手术，另8例为全膀胱切除术。病人年龄39～76岁，平均为58.9岁。肿瘤标本全部经病理证实为膀胱移行上皮细胞癌。肿瘤标本在手术室采集，如为经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT），则在电切肿瘤之前经膀胱镜留取肿瘤标本，以免肿瘤组织在高热的作用下发生组织形态学的改变。所有肿瘤标本统一采用10％的福尔马啉溶液固定，石蜡包埋，组织切片厚度为5μm。

　　49例膀胱肿瘤患者的一般临床资料见表1。

表1　49例膀胱癌细胞凋亡指数检测结果

临床资料	n	细胞凋亡指数(％，±s)
年龄（岁）
＜60	29	43.62±11.15
≥60	20	48.49±10.71
性别
男	43	44.69±10.31
女	6	55.48±13.49
肿瘤发病
原发	42	49.58±11.80
复发	7	23.14±13.36
肿瘤大小（cm）
≤1.5	23	46.23±11.50
＞1.5	26	45.95±10.29
肿瘤数目
单个	35	46.17±10.37
多个	14	44.14±13.26
肿瘤分级
Ⅰ	13	60.35±12.12
Ⅱ	26	46.48±11.17
Ⅲ	10	25.19±12.39
肿瘤分期
Ta	16	61.58±11.56
T1	3	42.48±10.87
T2～4	10	26.99±13.34
预后
肿瘤复发	8	22.02±12.14
肿瘤不复发	33	50.33±10.99

　　1.2实验方法

　　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记（TUNEL）法(Gavrieli,1992),TUNEL试剂盒为美国Oncor公司产品（Apop Taq Plus）。实验步骤：切片于二甲苯中脱蜡，无水乙醇、95％、70％乙醇水化；以浓度为20μg/ml蛋白酶K消化30分钟；3％H2O2封闭内源性过氧化物酶30分钟；配制含末端核苷酸转移酶和地高辛连接的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）反应液，滴加后于37℃孵育1小时；磷酸缓冲液（PBS）洗3次，再滴加连接有过氧化物酶的抗地高辛抗体，室温孵育30分钟；滴加3，3二氨基联苯胺（DAB），至出现棕黄色的阳性细胞后终止反应，甲基绿复染，树脂封片。

　　细胞凋亡指数（Apoptosis Index，AI）的计算：每张切片选择5个高倍视野（×400），其中阳性细胞数所占总细胞数的百分比。

　　1.3随访

　　对保留膀胱手术后的病人定期复查膀胱镜，术后一年内每3个月查膀胱镜1次，一年后每半年查膀胱镜1次。间隔期间如病人出现不能解释的血尿或排尿异常，则尽快安排膀胱镜检查，及时发现肿瘤复发。

　　1.4统计分析

　　采用方差分析进行统计学检验。2结果

　　膀胱癌凋亡细胞之染色特征为：核染色质呈棕黄色，表现为细胞核或凋亡小体的棕黄色。多数浓缩的核质紧贴于核膜周围，部分核质呈均匀染色。切片中可见到凋亡小体，呈散在分布（见图1）。

　　本研究49例膀胱癌标本共有6例未检查出细胞凋亡的存在，细胞凋亡的发生率为87.76％（43/49）。49例膀胱癌细胞凋亡指数为(45.66±12.49)％（均数＋标准差）。细胞凋亡指数大小与膀胱癌病人年龄、性别、肿瘤大小、数目等无关（P＞0.05）；但与膀胱癌的分级和分期有关（P＜0.01），即肿瘤“瘤级”越高其细胞凋亡指数越少，而浸润性膀胱癌（T_2～4）的细胞凋亡指数较浅表性膀胱癌（Ta和T1）低；复发膀胱癌其细胞凋亡指数明显较原发膀胱癌减少（P＜0.05）。

　　本研究病例经严格随访14～25个月（中位数为21.9个月），其中保留膀胱手术后的41例病人有8例发生肿瘤复发，肿瘤复发率为19.51％。在此期间内肿瘤复发者其肿瘤细胞凋亡指数明显较不复发的肿瘤降低（P＜0.05）。49例膀胱癌标本细胞凋亡检测结果在各组病人中的分布见表1。

图1　膀胱癌细胞凋亡检测（×400）

中棕黄色染色为凋亡细胞核或凋亡小体

　　3讨论

　　细胞死亡主要分为细胞坏死和细胞凋亡两种方式。细胞凋亡之词“apoptosis”来源于希腊文，意思是“花瓣或树叶的凋落”。与细胞坏死截然不同，细胞凋亡是机体细胞主动性死亡，是机体的一个重要生理过程，调节体内正常细胞的更新和清出异常细胞。病理状态下，细胞凋亡与肿瘤及多种疾病的发生发展有关。肿瘤的形成首先是凋亡抑制基因（如bcl-2等）的过度表达，细胞凋亡紊乱，使细胞容易发生原癌基因的激活、扩增或抑癌基因的缺失、突变等^[2]。Wright等人^[3]用10种致癌物质，如DDT、PMA、DES、42-P等作用于7种不同的细胞株，结果发现均有细胞凋亡的紊乱，最后导致细胞恶性变。

　　细胞凋亡的研究方法已从最初的形态学向分子生物学方向发展。TUNEL技术由Gavrieli等于1992年首先建立，其原理是通过TdT酶介导带有显色系统或荧光的dUTP连接于凋亡细胞或凋亡小体中由核酸内切酶所切断的3｀-OH末端DNA链缺口，从而得以识别和计数凋亡细胞。该方法特异性高，适用范围广，可作定量检查，是目前国际上研究细胞凋亡的首选方法之一^[4]。

　　有关膀胱肿瘤细胞凋亡的研究很少，报告的结果也不相一致。King等人^[5]研究结果表明，膀胱癌细胞凋亡指数明显高于癌旁正常膀胱粘膜，膀胱癌细胞凋亡与肿瘤分化程度以及肿瘤分期呈正相关，即肿瘤“瘤期”和“瘤级”越高，而细胞凋亡则越少。他们认为，肿瘤细胞凋亡可能与细胞增殖有关，肿瘤细胞凋亡快者其细胞凋亡相应也多；相反，细胞增殖越慢则细胞凋亡越少。如正常组织的细胞增殖明显低于肿瘤组织，因此其细胞凋亡很少。但肿瘤细胞与正常细胞的生物学行为完全不同，其各自的凋亡应遵循不同的规律进行。也有文献报告与上述结果相反或报告膀胱癌细胞凋亡与肿瘤分级和分期无关者。本研究膀胱癌细胞凋亡的发生率为87.76％，提示膀胱肿瘤中细胞凋亡的现象很普遍。膀胱癌细胞凋亡与病人年龄、性别、肿瘤大小、数量等无关，与肿瘤分级和分期呈负相关。提示膀胱肿瘤分化越差、肿瘤越到晚期，其细胞凋亡越少。

　　有关膀胱肿瘤细胞凋亡与病人预后的报告甚少。胃肠道肿瘤细胞凋亡与病人预后的报告表明：细胞凋亡多者，肿瘤病人预后较好；相反，细胞凋亡减少，则病人预后较差。本研究结果表明，复发肿瘤其细胞凋亡指数明显小于原发肿瘤，而随访结果亦显示肿瘤容易复发者其细胞凋亡指数明显较不复发的肿瘤减少。提示膀胱肿瘤细胞凋亡越少，其病人预后就越差。肿瘤细胞凋亡可能受多种因素的影响，包括肿瘤细胞自身的基因调控以及机体的抗肿瘤作用，如营养的供给和免疫作用等等。细胞凋亡（不包括细胞坏死）多者，说明肿瘤在各种因素的作用下，其生长繁殖受到限制，肿瘤的恶性程度低，因此病人预后较好；相反，细胞凋亡少则说明肿瘤受限制的程度差，肿瘤恶性程度高，以至病人预后较差。

　　目前，有关肿瘤细胞凋亡的研究尚未成熟。作者认为，肿瘤细胞凋亡的调控机制和具体过程可能与正常细胞完全不同，两者不能相提并论，其发展规律和机理有待进一步研究阐明。随着现代医学和分子生物学的不断发展，如何诱导肿瘤细胞凋亡可望为肿瘤治疗提供新的策略和方法。许多化疗药物，如环磷酰胺、长春新碱、VP-16等等均可通过诱导肿瘤细胞凋亡而产生抗肿瘤作用^[6]。希望在不久的将来，通过对细胞凋亡的全面了解，人类在与恶性肿瘤的抗争中能够取得突破性的进展。

　　[参考文献]

　　1，Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis： a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics [J]. Br J Cancer,1972,26： 239～ 245.

　　2，Korsmeyer SJ. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes： regulators of cell death [J]. Blood, 1992,80： 879～ 876.

　　3，Wright SC, Zhong J, Larrick JW. Inhibition of apoptosis as a mechanism of tumor promotion [J]. FASEB, 1994, 8： 654～ 659.

　　4，Gavrieli Y,Sherman Y,Bon-Sasson SA, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation [J]. J Cell Biol,1992,119： 493～ 501.

　　5，King ED, Matteson J, Jacobs SC, et al. Incidence of apoptosis,cell proliferation and bcl-2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder： association with tumor progression [J]. J Urol, 1996,155： 316～ 320.

　　6，Gorczyca W,Gong J,Ardelt B, et al. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various anti-tumor agent [J]. Cancer Res,1994,54： 3186～ 3192.

收稿日期：1999－08－30；修回日期：1999－12－30