低剂量丝裂霉素短时加药诱导膀胱癌细胞凋亡的研究

中华实验外科杂志 1999年第1期第16卷 膀光肿瘤

作者：符伟军　刘佳　郭丽　江岩　郭恩忠　严有农　李宏

单位：110031　沈阳医学院分子生物学研究室(符伟军、刘佳、郭丽、江岩、李宏)；解放军202医院泌尿外科(严有农)；中国医科大学附属第二医院泌尿外科(郭恩忠)

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；腔内化疗；丝裂霉素；细胞凋亡

　　【摘要】　目的　探讨低剂量丝裂霉素(MMC)短时处理，诱导膀胱癌细胞凋亡的可能性。方法　应用细胞和分子生物学技术检测各MMC处理条件对靶细胞生长和凋亡的影响。结果　低剂量MMC处理EJ细胞1小时或2小时，均出现典型凋亡特征，其中，100mg/L和20mg/L MMC对凋亡的诱导作用最佳且处理时间的长短，对抑癌结果无明显影响。结论　以一半的临床MMC用药剂量和时间即可有效诱导膀胱癌EJ细胞凋亡，为拟定更合理的膀胱癌腔内化疗方案提供可靠的实验佐证。

　　 Apoptosis of human bladder cancer EJ cells induced by low dose and short term mitomycin C treatment Fu Weijun, Liu Jia, Guo Li, et al. Department of Molecular Biology, Shenyang Medical College, Shenyang 110031

　　 　　【Abstract】 Objective To investigate the underlying molecular effects of mitomycin C (MMC) on bladder cancer EJ cells and to improve the current bladder cancer chemotherapy. Method The established human bladder cancer cell line EJ was cultured in conventional RPMI 1640 medium without or with MMC in the final concentrations of 5,50,100,200 and 1000 mg/L, respectively. After treating the cells for 1 or 2h, the MMC containing media were replaced with fresh medium. The cells were analyzed regularly with multiple approaches for morphological and biological studies.Result Either 1 or 2 h MMC transient treatment can suppress cell growth and induce typical hallmarks of apoptosis in a time course related manner. Treatment of EJ cells with 100 mg/L or 20 mg/L MMC for 1 or 2h had similar phenomena of perfect growth inhibition and apoptosis induction. Conclusion With at least half doses and treatment time of that of routine bladder instillation therapy, MMC may induce sufficient apoptosis of bladder cancer EJ cells.

　　 　　【Key words】 Bladder neoplasms Carcinoma Intravesical chemotherapy Mytomyicin C　Apoptosis

　　我们通过模拟临床膀胱腔内化疗的条件，以不同的丝裂霉素(MMC)剂量和用药时间处理人膀胱癌细胞系EJ，并对被处理细胞的生长和凋亡特点做系统性观察。

　　材料和方法

　　1. 细胞培养及药物处理　膀胱癌EJ细胞(北京医科大学泌尿外科研究所提供)，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，5%CO₂，37℃条件下培养，培养皿预置盖玻片，加入浓度为5×10⁷个/L

　　的EJ细胞，孵育24小时后将溶于培养液中的1g/L MMC(Japan)加入皿中，使各处理组的最终浓度分别达到5、50、100、200和1000mg/L处理2小时或1小时后，吸出药液，常规培养液冲洗细胞2次，正常培养之，以24小时的间隔取片，常规固定，HE染色，细胞形态学观察，正常培养细胞作为未处理对照。

　　2. 凋亡细胞的鉴别　取细胞盖玻片，用末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记(TUNEL)试剂盒(B.M.Germany)对各组细胞DNA片断化情况加以分析，实验步骤按说明书进行，正常培养细胞做非处理对照；省略TUNEL标记步骤的玻片做阴性(背景)对照。

　　3. 细胞DNA合成活性的MTT测定　将浓度10⁸/L细胞悬液，加入96孔酶标板中，以不同浓度MMC处理细胞1小时或2小时，测定各实验组细胞的DNA合成情况，MTT测定方法见以往所述^［1］。每一实验重复测定2次，取平均值，以曲线形式反应之。

　　4. DNA提取及电泳分析　收集处理1小时的EJ细胞，用适量DNA/RNA/蛋白质三重提取液Tristar制备细胞裂解匀浆，等量氯仿抽提后，中间相和有机相经等量100%乙醇抽提，离心，沉淀物冲洗后用T₁₀E₁溶解，取6μg DNA在含溴乙淀的1.2%琼脂糖内电泳分离，照像。未处理细胞的DNA做正常对照。

　　结　果

　　1. MMC对EJ细胞生长和形态的影响　对5，50，100，200，1000mg/L MMC处理2小时和1小时的EJ细胞所做连续性观察发现，与正常培养细胞比较，1000mg/L组：处理24小时内，大部分细胞死亡，少量贴壁细胞体积肿胀，出现核固缩，碎裂和溶解等坏死现象；第72小时细胞全部死亡。200mg/L组：胞体变小，出现围绕核膜的染色质固缩和胞膜“发疱”现象；部分细胞碎裂成数个有核结构的凋亡小体。凋亡细胞随时间而增多且在同一细胞群体中，可见多种凋亡状态。100mg/L组的情况与200mg/L组十分相似。而50mg/L和5mg/L组：24小时有少量凋亡细胞，然后日渐增多，第5天，大多数细胞死于凋亡，凋亡核的TUNEL染色显示，MMC的凋亡诱导作用在5、50和100mg/L处理组间呈剂量相关性，在100和200mg/L两组间无显著性差异(P＞0.05)。

　　2. DNA合成活性的MTT测定　不同浓度MMC短时间处理均可有效抑制EJ细胞增殖，在50mg/L和200mg/L处理组，有差异(P＜0.05)，但100mg/L和200mg/L的抑癌效果却十分相似，此外，用各浓度MMC处理细胞1小时或2小时，并未发现任何显著性差异。

　　3. DNA片段化分析　对不同浓度MMC处理1小时的EJ细胞所做DNA电泳分析显示，处理后第24小时，便可观察到DNA片段化改变，这种现象随时间延长而愈趋明显，但无典型梯状DNA片段形成。

　　讨　论

　　我们以往的研究表明，持续使用低浓度(5mg/L)MMC可有效诱导体外培养的EJ细胞凋亡。我们模拟腔内化疗的条件，以小剂量MMC短时间(1或2小时)处理EJ细胞发现，尽管药物浓度明显降低，但MMC仍能以时效相关性方式使绝大多数被处理细胞在5天内死于凋亡。其中，用100mg/L处理无论在抑制生长还是促进凋亡方面均与200mg/L的效果相似，说明100mg/L是更为合理的药物浓度。已知药物高浓度时细胞死于坏死，而合适浓度时，细胞则趋向凋亡^［2］。这个现象也在1000mg/L和100～200mg/L处理的EJ细胞群体中看到，由于坏死和凋亡同为不可逆的细胞死亡，尽可能降低药物浓度而最大程度诱导癌细胞发生凋亡正成为癌化疗的重要准则。

　　药物在腔内的存留时间是影响化疗效果和引起副反应的另一重要因素。延长药物的作用时间可能提高杀伤肿瘤细胞的程度。用相同浓度(如100和200mg/L)MMC处理细胞2小时或1小时，能获得相似的诱导凋亡效果，这提示激活癌细胞内在的自杀程序可能更与药物的作用机制和有效浓度而非作用时间有关。最近报道，由c-myc, CD95和CD95L构成的控制凋亡的“分子开关”位于细胞表面，很易被外来凋亡诱导因素“开启”；一旦“开启”便使靶细胞步入不可逆转的凋亡进程^［3］。该理论为本文结果，即低浓度MMC短时间作用便能诱导EJ细胞凋亡，提供一种解释。综上所述，本研究模拟膀胱癌腔内化疗条件发现：用临床常规治疗一半的MMC剂量和处理时间可获得相同的抑癌结果，但改善现行膀胱癌临床化疗方案的实际可能性及MMC介导EJ细胞凋亡的内在调控机制，有待进一步研究。

　　本课题为沈阳市科委重点科研资助项目(No.9641450426)

　　 参考文献

　　1　Liu J, Li H, Hamon M-f, et al. IL-6 stimulates growth and inhibits constitutive,protein synthesis- insependent apoptosis of murine B-cell hydridoma 7TDI cell. Immunol, 1994, 155:428-435

　　2 Bonfoco E, Krainc D, Ankarcrona M, et al. Apoptosis and necrosis: Two distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with N-methy1- d- aspartate or niyric oxide/superoxide in cortical cell culture. Proc NatI Acad Sci USA, 1995, 92:7162-7166

　　3 De Maria R, Lenti L, Malisan F, et al. Requirement for GD3 ganglioside in CD95- and ceramide-induced apoptosis. Science, 1997, 277:1652-1655

(收稿：1998-04-10　修回：1998-09-10)