尿液中膀胱癌肿瘤标记物检测新进展
中国肿瘤临床1999年第26卷第6期Vol.26No.6 1999
肖泽均 马建辉
关键词：尿液肿瘤标记物 膀胱癌
膀胱癌传统的诊断方法是静脉尿路造影、膀胱镜检查等，而肿瘤组织活检是目前诊断膀胱癌及判定复发的金标准。但损伤性检查往往给患者带来难以克服的痛苦和恐惧。人们一直期望通过简单、方便和高特异性的尿液检查法诊断膀胱癌及判定治疗后是否复发。尿液细胞学检查阳性率与肿瘤类型及癌细胞的分级、检测者的知识、经验、专业技术等有关，其敏感性只有22％～62％。随着免疫学及细胞分子生物学技术日新月异的发展，人们对肿瘤本质的认识更加深入，不断有新的肿瘤标记物被发现，并得到很好的发展，有的甚至已经制成商业化试剂盒。一个较为完美的肿瘤标记物应具备以下特点：1)由肿瘤细胞产生，并能在体液和肿瘤组织中检测到，而在正常人和非肿瘤患者中不能检测到；2)应有足够的量用以肿瘤的早期检测；它在体液中的水平应与肿瘤的进展直接相关，且能在无临床表现时即被发现；3)它还应与肿瘤的治疗效果相关[1]。近几年来，经尿液检测肿瘤标记物诊断膀胱癌有了许多新的进展。
1 核有丝分裂蛋白（Nuclear mitotic protein,NMP）与膀胱癌的诊断
NMP是支持细胞核的一种网状结构蛋白，在DNA复制、转录及基因表达过程中起重要作用。其中的NuMA(Nuclear mitotic appratus protein)是一种分子量为236KD的核磷酸蛋白，在有丝分裂时与纺锤体密切相关，Western斑点杂交法则主要显示220和205KD两条带[2]。大量研究表明，NuMA在肿瘤细胞及体液中均过量表达。NMP22检测试剂盒通过双单抗夹心酶联免疫法来检测尿液中NuMA的水平。血尿及BCG膀胱内灌注后的尿液均不影响检测结果[3]。
1996年，Carpinito等用NMP22检测试剂盒对375例正常志愿者，117例泌尿道良性疾病患者及175例膀胱移行细胞癌患者的尿液分别进行了检测，结果发现：正常志愿者和泌尿道良性疾病患者尿液中的NMP22水平分别为2.9和3.3U/ml，没有种族、年龄的差别，也不受吸烟、其它非泌尿疾病如糖尿病、心血管疾病、自身免疫疾病和肾功不全等因素的影响。而移行细胞癌患者的NMP22为6.04U/ml，与前两组有显著差异。他们的研究还发现，移行细胞癌患者的NMP22水平不受化疗、肿瘤恶性程度及范围的影响，因此明显优于尿液细胞学检查[4]。
Soloway等人用NMP22对膀胱移行细胞癌患者手术后的复发进行了监测，结果表明NMP22对膀胱癌复发有很高的预测性，其中阴性预测率达86％，浸润性癌100％，总的阴性预测率达70％[5]。Carpinito等对此有相同的报道，用NMP22监测膀胱移行细胞癌患者手术后复发的敏感性为73.9％，特异性78.2％，准确性76.9％，阳性预测率58.6％，阴性预测率87.8％[6]。
由于NMP22检测试剂盒已经商品化，它的高敏感、高特异及非损伤性为膀胱癌的诊断、监测复发提供了一条简单、方便的新途径，是一种具有广泛应用前景的肿瘤标记物。
2 端粒酶（Telomerase）与膀胱癌的诊断
大量研究表明，端粒酶及其底物端粒与肿瘤细胞的无限增殖性密切相关。端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，主要起稳定染色体、防止染色体降解、融合等作用，也是DNA复制所必需的。端粒酶则是合成端粒DNA顺序中富含G碱基的一种核糖核蛋白逆转录酶，主要功能是维持端粒的稳定性。就目前的研究来看，98％细胞系的细胞和90％的肿瘤细胞可检测到端粒酶的活性，而已被检测的50种正常人类体细胞均未发现端粒酶的活性。因此，许多学者认为端粒酶可能与肿瘤发生有关，且可能是肿瘤发生发展早期事件。PCR技术的发展，为其活性的检测提供了极大的便利。端粒重复扩增方法（the telomeric repeat amplification protocol,TRAP）已被许多学者应用。
1996年，Yi Lin等检查了40例膀胱癌、7例正常组织和2例不典型增生膀胱癌上皮的端粒酶活性，并与临床分期和病理分级进行了比较。发现97.5％的膀胱癌显示了该酶活性，而正常组织无1例有酶活性。其中100％侵润性肿瘤显示高活性，13/24(54％)表浅性肿瘤及1例不典型增生显示低活性。这些结果表明端粒酶的表达与临床分期和病理分级密切相关，其活性可能在肿瘤发生的亚临床阶段就已经表现并可检测到[7]，有利于膀胱癌的早期诊断。Yang及Yoshida的研究也支持这一推断，且他们对膀胱冲洗液及尿液标本进行的端粒酶活性检测结果表明，完全可以替代组织标本[8]。
1997年，Kinoshita等对45例膀胱癌患者手术前膀胱冲洗液及尿液端粒酶活性的检测结果显示：阳性率为89％，而尿液细胞学检查阳性率仅42％，同期检测12例无癌患者皆为阴性。此外，尿液端粒酶活性与癌细胞分级也有关，G1阳性率为75％，G2为96％，而同组尿液细胞学检查阳性率则分别为8％和46％[9]。Dalbagni等对术后膀胱癌复发者的端粒酶活性检测得到相似的结果[10]。
研究提示，尿端粒酶活性检测不仅为膀胱癌的早期诊断和复发监测提供了一种无损伤高敏感的手段，尤其对恶性程度不高的膀胱癌的诊断比细胞学检查具有更敏感及更客观的优势。
3 透明质酸和透明质酸酶（Hyaluronic acid and hyaluronidase）与膀胱癌的诊断
许多研究表明，细胞外间质及其降解酶与肿瘤的浸润、转移密切相关，如某些成分及其降解酶可调节肿瘤细胞的迁移、附着及穿过基膜进行浸润，还可通过调节内皮细胞的功能来调节肿瘤血管的形成。透明质酸是一种葡聚糖，是细胞外间质的一种主要成分，也存在于体液和结缔组织中，与一些正常生理功能的调节相关，但在某些病理条件下如肿瘤中也有重要作用。透明质酸水平在某些动物肿瘤模型及人类肿瘤细胞中明显升高。透明质酸酶是透明质酸的降解酶，脊椎动物的透明质酸酶可分为两大类：一类在中性条件下（pH理想值5.0）有活性，如睾丸透明质酸酶；另一类在酸性条件下（pH3.5～4.0）有活性，如肝透明质酸酶[11]。透明质酸酶降解透明质酸，形成一种3～25个二糖单位的小片断，促进血管形成[12]。人们已经观察到在膀胱癌患者中透明质酸水平明显升高，促血管形成的小片断也可在高恶性的膀胱癌患者尿液中检测到[13]。因此，透明质酸和透明质酸酶显然也可作为一种肿瘤标记物用于膀胱癌的诊断。
1997年，Pham等对139例尿样本进行了检测，结果发现，G2/G3级膀胱癌患者尿液中的透明质酸酶水平（33.4±4.5毫单位/毫克蛋白）比正常人（4.2±1.2毫单位/毫克蛋白）、G1级患者（6.5±1.7毫单位/毫克蛋白）和其他泌尿生殖疾病患者（7.4±1.4毫单位/毫克蛋白）高5～8倍，对G2/G3级膀胱癌检测的敏感性达100％，特异性达88.8％。这是由于肿瘤组织中透明质酸酶升高的缘故[14]。
Lokeshwar等则对尿液中透明质酸的水平进行了检测，发现不仅G2/G3级膀胱癌患者尿液中的透明质酸水平升高，G1级患者也升高。在对144例样本的分析中，G1级患者尿液中的透明质酸水平255±41.7ng/mg，G2级：291.8±68.3ng/mg，G3级：428.3±67ng/mg，比正常人44.7±6.2ng/mg和其他泌尿生殖系疾病患者69.5±6.8ng/mg明显升高（P＜0.001）．对膀胱癌症的诊断的敏咸性为91.9%，特异性92.8%，而且还发现透明质酸的大小也有不同．正常人及低度恶性肿瘤患者尿液中，是中等片断的透明质酸，高恶性膀胱癌则出现促血管形成的小片断[13]．
这些检测用的都是简单的ELISA－LIKE法，只需有透明质酸结合蛋白即可，而这种蛋白又是可大量制备并纯化的。透明质酸－透明质酸酶尿液检测无疑也可提供一种简单、无损伤且敏感性、特异性均高的诊断途径，它还可判断肿瘤的恶性程度，对判断疗效及复发也有帮助。
4 其它
膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen,BTA）由患者膀胱肿瘤上分离下来的基膜复合物组成，它是一种独特的高分子量蛋白水解的降解复合物，由特定的16和165KD多肽组成，在肿瘤增殖过程中可在尿液里发现[15]。Sarosdy等采用BTA尿液检测法对膀胱癌复发的诊断和监测作了前瞻性双盲试验，并与尿液细胞学检查进行了比较，发现BTA尿液检测对膀胱癌复发的诊断比尿液细胞学检查更敏感，且特异性高达95.9％。对低度恶性肿瘤的诊断也比尿液细胞学检查更敏感[16]。
CD44，一种广泛分布于细胞表面的糖蛋白，被认为是一种细胞外黏附分子。据报道，在多种人类肿瘤中，其基因剪接方式有明显改变。免疫组化分析表明，肿瘤进程与CD44的表达量及分布密切相关[17]。在尿液脱落癌细胞中，CD44基因也有异常转录[18]。Western杂交试验发现，在75％膀胱癌患者尿液细胞溶解产物中发现几种高分子量的CD44(≥160KD)，对照组则无。免疫组化研究发现，随着正常膀胱粘膜表皮细胞的分化和成熟，CD44蛋白表达下降，而癌细胞中的CD44蛋白则过量表达并可穿透表皮层进入尿液中。这些都显示CD44蛋白可作为一种潜在的膀胱癌诊断肿瘤标记物[19]。
随着原发性膀胱癌的发生和进展，出现许多明显的基因改变。而利用PCR技术可以比较简单地检测微卫星灶（Microsatellite）DNA的改变，且耗费相对较少。Mao等在研究中发现，微卫星灶DNA在检测原发性膀胱癌时，敏感性可达95％，而相应的尿液细胞学检查只有50％[20]。癌基因p53的突变，也为膀胱癌的尿液诊断提供了一个较好的分子标记物，但由于其突变发生相对较晚，所以应用上有所限制。还有自分泌能动因子受体（Autocrine motility factor recepter）、生长因子（Growth factors）、M344及Lewis－X抗体等的检测，均可作为潜在的诊断手段。
综上所述，尿液中肿瘤标记物的检测在膀胱癌诊断和监测复发中的研究越来越多，有的已从试验走向了临床。由于这些方法具有潜在优势，必将成为膀胱癌尿液诊断的一个主要发展方向。
作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院（北京市 100021）
参考文献
1 Bates SE,Longo DL. Oncogenes,growth factors and control of the cell cycle. Cancer Surv,1987;16:201
2 Zeng C,He D,Brinkley BR. Localization of NuMA protein isoforms in the nuclear matrix of mammalian cells.Cell Motil Cytoskeleton,1994;29:167
3 Merrifield SA,Roos R,Shapiro K,et al. An immunoassay that quantifies the level of a nuclear matrix protein in the urine of patients with bladder cancer.(Submitted).1996
4 Gennaro AC,Walter MS,Joseph VB,et al. Urinary nuclear matrix protein as a marker for transitional cell carcinoma of the urinary tract.J Urol,1996;156:1280
5 Mark SS,Joseph VB,Gennaro AC,et al. Use of a new tumor marker,urinary NMP22,in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract following surgical treatment. J Urol,1996;156:363
6 Carpinito GA,Chodak G,Church P,et al. A tumor marker for transitional cell carcinoma with high sensitivity.Oral presentation to the New England American urology Association Conference,Newport,RI.1995
7 Yi Lin,Hiroshi Miyamoto,Kiyoshi Fujinami,et al. Telomerase activity in human bladder cancer.Clin Cancer Res,1996;2:929
8 Kazuhiro Y,Takashi S,Hidetoshi T,et al. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer cells on urine.Cancer,1997;79:362
9 Hidefumi K,Osamu O,Yoshiyuke K,et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer. J Natl Cancer inst,1997;89:724
10 Dalbagni G, Han W, Zhang ZF, et al. Evaluation of the telomeric repeat amplification protocol assay for telomerase as a diagnostic modality in recurrent bladder cancer.Clin Cancer Res,1997;3:1593
11 Lin Y,Mahan K,Lathrop WF, et al. A hyaluronidase activity of the sperm plasma membrane protein PH－ 20 enables sperm to penetrate the cumulus layer surrounding the egg.J Cell Biol,1995;125:1157
12 West DC,Hampson IN,Arnold F, et al. Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid.Science,1985;228:1324
13 Lokeshwar VB,Obek C,Soloway MS, et al. Tumor－ association of hyaluronic acid:a new sensitive and specific marker for bladder cancer. Cancer res,1997;57:773
14 Henri TP,Norman LB,Vinata BL. Tumor derived hyaluronidase: A diagnostic urine marker for high－ grade bladder cancer. Cancer Res,1997;57:778
15 Tribukait B. Flow cytometry in surgical pathology and cytology of tumors of the genito－ urinary tract. In: Advances in Clinical Cytology. Edited by Koss lG, Coleman DV. New York:Masson Publishing USA, Inc 1984,Vo1 2 Chapt 8
16 Sarosdy MF,Devere White RW,Soloway MS, et al. Results of a multicenter trial using the BTA test to monitor for and diagnose recurrent bladder cancer.J urol,1995;154:379
17 Wielenga VJM,Heider KH,Offerhaus GJA, et al. Expression of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer res,1993;53:4754
18 Matsumura Y, Hanbury D, Smith J, et al. Non－ invasive detection of malignancy by identification of unusual CD44 gene activity inexfoliated cancer cells.BMJ,1994;308:619
19 Sugiyama M,Woodman A,Sugion T, et al. Non－ invasive detection of bladder cancer by identification of abnormal CD44 proteins in exfoliated cancer cells in urine. J Clin Pathol, Mol Pathol,1995;48:142
20 Li Mao, Mark PS,Marshall S,et al. Molecular detection of primary bladder cancer by microsatellite analysis. Science,1996;271:659
（杨红欣校对)
（收稿日期：1998－05－26）
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