应用彩色多普勒能量图观察鱼精蛋白治疗前列腺癌鼠模型的疗效
中国超声医学杂志 2000年第12期第16卷 基础研究
作者：唐杰 董宝玮 杨玉英 张晶 石怀银 王显芝
单位：唐杰 董宝玮 张晶（100853 北京市，解放军总医院超声科）；石怀银（病理科)；杨玉英 王显芝（进修生）
关键词： 彩色多普勒能量图；血管生成；微血管密度；前列腺癌
摘 要 目的：评价彩色多普勒能量图(CDE)在血管生成抑制剂治疗前列腺癌鼠模型中的检测作用。方法：将人PC-3m前列腺癌块移植于24只Balb/C雄性裸鼠皮下。选用鱼精蛋白作为血管生成抑制剂。荷瘤裸鼠分成大剂量组、小剂量组和对照组，并分别皮下注射鱼精蛋白。计算机辅助测定CDE血流信号像素网格数，并与肿瘤微血管密度(MVD)对照分析。结果：大剂量组、小剂量组和对照组的血流信号平均像素网格数分别为1.44、2.13、5.75(P＜0.05～0.01)，三组MVD分别为9.63、28.63和46.13(P＜0.01)、像素网格数与MVD的相关系数为0.7831～0.9243(P＜0.01)。结论：CDE可以用于血管生成抑制剂疗效的判定。
Evaluation of Color Doppler Energy in the Mouse Model
of Prostatic Carcinoma Treated by Protamine
Tang Jie Dong Baowei Yang Yuying
Dept.Ultrasound,General Hospital of PLA, Beijing 100853 China
ABSTRACT Objective:To evaluate the value of color Doppler energy (CDE)in the mouse model of prostatic carcinoma treated by protamine.Methods：Tumor piece of the human prostatic carcinoma(PCA)PC-3m was transplanted subcutaneously into 24 Balb/C male nude mice.Protamine was selected as the inhibitor of angiogenesis.The mice were divided into high dose,lower dose and control gloups.Protamine was injected subcutaneously.The grid number of Doppler signals pixel was mesaured with the computer.The results of Doppler flow were comp ared with microvessel density(MVD).Results:The mean grid number of Doppler signals pixel in high dose,lower dose and control was 1.44,2.13,5.75 respectively(P＜0.05－0.01).The mean MVD of the 3 groups was 9.63，28.63，46.13(P＜0.01).The correlative coefficient between Doppler signal and MVD was 0.7831～0.9243(P＜0.01).Conclusion:The effect of the inhibitor of angiogenesis in the treatment of the tumors can be identified by CDE.
KEY WORDS Color Doppler Energy Angiogenesis Microvessel density Prostatic carcinoma
前列腺癌具有较高的复发率和转移率，加之相当一部分患者在确诊时已经失去手术机会，因此，积极开展与前列腺癌相关的研究，是提高我国前列腺癌患者生存率的重要环节〔1〕。本研究首次选用具有血管生成抑制作用的鱼精蛋白治疗前列腺癌鼠模型，并应用彩色多普勒能量图(CDE)观察其疗效，以评价CDE在血管生成抑制剂治疗肿瘤过程中的作用。
资料与方法
前列腺癌鼠模型和分组：在皮下接种有人PC-3m前列腺癌株(由北京医科大学泌尿外科研究所提供)的Balb/C雄性裸鼠癌结节长至最大径线10mm时，处死裸鼠，取出肿瘤并剪碎至1～2mm，再将剪碎的癌块移植于24只周龄为4～6周的雄性裸鼠皮下。选用鱼精蛋白(protamine)作为肿瘤血管生成抑制剂。在荷瘤裸鼠癌块长至最大径线为5.00mm时，随机分成3组，即大剂量组(皮下注射鱼精蛋白120mg/kg/次，次/12小时)、小剂量组(皮下注射鱼精蛋白60mg/kg/次，次/12小时)和对照组(根据裸鼠体重皮下注射与大剂量组鱼精蛋白等量的生理盐水，次/12小时)，疗程10天，每组8只裸鼠。裸鼠肿瘤体积计算公式：肿瘤体积＝6/π×L×W×H(L：长，W：宽，H：高)〔2〕。
CDE检查：超声仪为HDI-5000彩色多普勒超声仪，线阵式超宽频探头，频率为5.0～12.0MHz；多普勒增益为60～70%。选用3%戊巴比妥钠，剂量为35mg/kg，腹腔内注射。在裸鼠麻醉后进行CDE检查，并运用计算机Photoshop的网格功能，使图像出现均匀分布的网格，然后人工计算彩色血流信号占有的像素网格数。
免疫组化：将裸鼠肿瘤组织切片用兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(抗Ⅷ因子)(北京中山生物技术有限公司)染色，并采用单盲法行肿瘤微血管密度(MVD)计数。将光镜400倍下最高的MVD计数(Hot-spots)作为最终结果〔3〕。
结 果
1.肿瘤体积：裸鼠肿瘤生长曲线见图1。鱼精蛋白能有效抑制肿瘤体积增大，大剂量、小剂量组的平均肿瘤体积明显小于对照组，分别为294.97mm3、424.02mm3和1427.97mm3(P＜0.01)；大剂量组与小剂量组比较，肿瘤体积相差不显著(P＞0.05)。
图1 裸鼠肿瘤生长曲线
2.肿瘤血流信号像网格素数：大剂量组、小剂量组和对照组的肿瘤血流像网格素数分别为1.44、2.13和5.75。三组结果相差显著，P值＜0.05～0.01(图2、3)。
图2 CDE显示大剂量组肿瘤周边血流(箭头所示)
3.MVD计数：微血管可以出现在肿瘤内任何部位，但MVD最高的部位常位于肿瘤的周边部，且随鱼精蛋白剂量的增加而减少。大剂量组、小剂量组和对照组的MVD分别为9.63、28.63和46.13。三组结果相差显著，P值＜0.01(图4、5)。
图3 CDE显示对照组肿瘤内血流(箭头所示)
图4 大剂量组 光镜400倍见微血管分布情况，抗Ⅷ因子染色后，微血管呈棕色
图5 小剂量组 光镜400倍见微血管分布情况，抗Ⅷ因子染色后，微血管呈棕色
4.血流信号平均像素网格数与MVD的相关性：CDE检测的血流信号像素网格数与MVD的相关系数为0.7831～0.9243，P＜0.01。
讨 论
运用肿瘤血管生成抑制剂治疗各种恶性肿瘤是当前肿瘤治疗研究的热点之一，将为肿瘤治疗开辟新的途径。本研究选用具有血管生成抑制作用的鱼精蛋白治疗人PC-3m前列腺癌鼠模型，以探索血管生成抑制剂治疗前列腺癌的CDE检查意义。
1.鱼精蛋白能有效抑制肿瘤的生长：1982年，Taylor报道鱼精蛋白能有效抑制黑素瘤B16新生血管生长，进而抑制瘤体增长〔4〕。1998年，Arrieta运用鱼精蛋白治疗C6大鼠神经胶质瘤，发现治疗效果与鱼精蛋白的剂量呈正相关〔5〕。本实验结果显示鱼精蛋白能抑制人PC-3m前列腺癌的肿瘤生长，其中大剂量、小剂量组的平均瘤体明显小于对照组瘤体(P＜0.01)。
鱼精蛋白抑制新生血管生长的机理还不十分清楚，观察到的作用有以下几个方面：①阻止起源于血小板的血管内皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子(FGF)和碱性FGF到细胞感受器上；②有效阻止血管内皮细胞的有丝分裂和移动；③降低纤维蛋白溶解酶原活化剂的组织浓度；④使FGFs和血管内皮生长因子(VEGF)对血管内皮细胞膜和细胞基质外的与肝素相关的糖蛋白不稳定，使这些因子对蛋白溶解更敏感〔6〕。鱼精蛋白除能抑制肿瘤新生血管生长之外，还能抑制胚胎、炎症、免疫反应的毛细血管生长。但是，对于已经发育完善的血管则无抑制作用。
2.CDE能有效显示血管生成抑制剂治疗引起的肿瘤血流变化：1993年，Rifkin首次报道了彩色多普勒超声在前列腺疾病诊断中的应用，其中7%的前列腺癌患者是依靠彩色多普勒发现病灶〔7〕。1998年，Sakarya运用CDE检查220例前列腺患者，其结果显示CDE对前列腺癌的诊断敏感性是90%，阳性预测值为82%〔8〕。本研究结果表明CDE能敏感地显示鱼精蛋白治疗前列腺癌鼠模型引起的肿瘤血流变化，治疗组和对照组的平均血流信号像素网格数相差明显(P＜0.01)。本实验应用CDE实现了对荷瘤裸鼠前列腺小癌肿血流研究，提示CDE能应用于实验肿瘤的血流研究。
3.多普勒血流信号像素网格数与MVD之间存在很好的相关性：MVD是Weidner于1991年首次提出的微血管定量指标，现已广泛应用于不同种类的肿瘤血管研究中〔3〕〕。在本实验中，大剂量组、小剂量组的MVD明显小于对照组(P＜0.01)，且MVD随鱼精蛋白剂量的增加而明显下降。由于MVD主要分布于肿瘤生长活跃的周边区，因此，在肿瘤的介入性治疗过程中，如何有效抑制肿瘤周边微血管生长是治疗成功的关键之一。
我们通过计算机辅助定量测定多普勒血流信号，即肿瘤血流信号的像素网格数，这既有利于客观分析肿瘤血流信号的变化特征，也便于和MVD作相关性研究。本实验结果显示CDE测定的肿瘤血流信号变化与MVD之间具有很好的相关性(P＜0.01)，从而说明多普勒超声是一项可靠的肿瘤血流检测手段，有助于血管生成抑制剂疗效的观察。
该课题得到军队医药卫生科研基金(项目编号：98D058)资助
参考文献
1，王有广，马腾骧.前列腺癌的诊断与临床分期.中华泌尿外科杂志，1995,16:102～104.
2，Tamayko M,Reynolds P.Determination of subcutaneous tumor size in athymic(nude)mice.Cancer Chemother Pharmacol,1989,24:148～154.
3，Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinona.N Engl J Med,1991,324:1～8.
4，Taylor S,Folkman J.Protamine is an inhibitor of angiogenesis.Nature,1982,27:307～312.
5，Arrieta A,Guevara P,Reyes S,et al.Protamine inhibits angiogenesis and growth of C6 rat glioma;A synergistic effect when combined with carmustine.Eur J Cancer,1998,34:2101～2106.
6，Kersten JR,Pagel PS,Warltier DC.Protamine inhibits coronary collateral development in a canine model of repetitive coronary occlusion.Am J Physiol,1995,268:H720～H728.
7，Rifkin MD,Sudakoff G,Alexander AA.Prostate:Techninques,results,and potential applications of color Doppler US scanning.Radiology,1993,186:509～513.
8，Sakarya ME,Arslan H,Unal 0,et al.The role of power Doppler ultrasonography in the diagnosis of prostate cancer:A preliminary study.Br J Urol,1998,82:386～388.
(2000-07-06收稿,163天刊出)
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