鼻咽癌微血管与远处转移关系的初步研究

中华耳鼻咽喉科杂志 1998年第2期第33卷 临床研究

作者：钱朝南　闵华庆　梁小曼　郑树森　林汉良

关键词：鼻咽肿瘤；肿瘤转移；诊断；计算机辅助；微循环

　　【摘要】　目的　研究肿瘤血管参数改变在鼻咽癌远处转移中的意义及其评价预后的作用；并由此探讨抗血管生成治疗预防鼻咽癌远处转移的可能性。方法　 选择52例初治转移鼻咽癌，与另52例初治无转移且长期无瘤生存的鼻咽癌在性别、年龄（相差不大于5岁）、T分期和N分期方面进行一对一配对，取其肿瘤组织进行微血管的免疫组化染色和计算机图象分析，配对比较4个参数：微血管计数、微血管相对面积、平均血管面积和平均血管周长。并分析这些参数在各型转移鼻咽癌中的差异。结果　 转移鼻咽癌的微血管计数与微血管相对面积均显著高于非转移组，而转移鼻咽癌的平均血管面积和平均血管周长均显著小于非转移鼻咽癌。上述4个参数在单纯型转移和复合型转移之间，以及单纯骨转移、肝转移、和肺转移之间并无显著性差异。 结论　 肿瘤血管参数的改变与鼻咽癌转移密切相关，可作为预后因素进一步研究，并为预防远处转移的临床综合治疗以及抗血管生成治疗的研究提供依据。

Preliminary study on the correlation between neovasculature and metastatic

　　nasopharyngeal carcinoma by computer image analysis

Qian Chaonan,Min Huaqing, Liang Xiaoman,et al. Department of Nasopharyngeal Carcinoma, Tumor Hospital, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060

　　【Abstract】　Objective　To investigate the significance of neoangiogenesis in metastasis of nasopharyngeal carcinoma (NPC) so as to clarify further the role of neovascularity in evaluating the prognosis of NPC and the probability of antiangiogenesis in preventing distant metastasis of NPC .Methods Fifty-two patients with metastatic NPC were selected and strictly matched in sex, age, T stage, and N stage with another 52 patients with non-metastatic NPC and survived a long time. The tumor tissues of all 104 patients were retrieved for computer-assisted, immunohistochemical analysis of tumor vasculature.Results Counts of microvessel and relative area of all microvessels per image were significantly higher in metastatic NPCs than those of curable, non-metastatic NPCs; while average area of microvessel and average perimeter of microvessel in metastatic NPCs were smaller than those of the opposite. No significant difference in any microvessel parameter had been found among various types of metastasis.Conclusions The alterations of microvessel parameters bore significant relationships with metastases of NPC. Evaluation of neovascularity with computer image analysis may help in estimating the prognosis of NPC and in finding out the indications for aggressive multimodal treatments. Angiogenesis inhibitors might be helpful in preventing NPC from distant metastasis.

　　【Key words】　 Nasopharyngeal neoplasms 　　 Neoplasms metastasis 　　 Diagnosis, computer-assisted

　　Microcirculation

　　在头颈肿瘤中鼻咽癌远处转移的发生率最高^［1］，尤其是颈部巨大淋巴结者，其远处转移率高达50%～57%^{［1, 2］}。事实上16%的淋巴结阴性鼻咽癌治疗后最终也会发生远处转移^［2］。临床实践提示相同分期的鼻咽癌对相同治疗的反应以及临床转归可不相同。因此寻找与远处转移密切相关的预后因素有利于早期发现远处转移的高危人群，并给予针对

　　作者单位: 510060 广州 中山医科大学肿瘤医院鼻咽癌科（钱朝南、闵华庆），病理科（梁小曼、林汉良)；中山医科大学医学图像分析室（郑树森）

　　性的辅助治疗。越来越多的证据已证实肿瘤的生长和转移是血管生成依赖性的^［3］。自从Weidner等^［4］报道可用测量肿瘤中血管密度的方法来评价肿瘤血管生成，人们已发现许多肿瘤的血管密度与肿瘤转移率呈正相关而与生存时间呈负相关^［3］。为探讨肿瘤血管生成与鼻咽癌远处转移的关系、及其在不同转移类型之间有无差异，我们用计算机图像分析系统对经von Willebrand因子（旧称VIII因子）进行免疫组化染色的病理切片行有关血管参数定量分析^［5］。

材料和方法

　　一、 病例选择

　　收集52例1991～1992年在我院诊治的初治转移鼻咽癌（M₁），与另组52例无转移鼻咽癌（M₀）且治疗后无瘤生存5年以上者，在性别、年龄（相差不大于5岁）、T分期、和N分期上进行配对。临床分期用 ′92鼻咽癌分期。各组均为：男42例，女10例；T₁ 1例，T₂ 12例，T₃ 30例，T₄ 9例；N₀ 1例，N₁ 8例，N₂ 30例，N₃ 13例。转移组年龄为20～66岁，平均44.7岁；无转移组年龄为22～68岁，平均46.1岁。按WHO新病理分类重新评价病理切片，转移组和无转移组的鳞状细胞癌、分化型非角化癌、和未分化癌分别是1、5、46例和1、6、45例。无转移组中位随访时间为73个月。转移组患者多数接受姑息性放射治疗。无转移组患者均接受根治性放射治疗，其中7例较晚期患者还接受两程诱导化学治疗。

　　二、 转移分类

　　改良了Teo 等^［6］ 的分类法，将远处转移分成5种单纯型，即：骨转移型、肝转移型、远处淋巴结转移型（锁骨以下的淋巴结）、肺转移型、和脑转移型。兼有上述两种以上转移类型的属复合转移型。52例转移鼻咽癌中11例为复合型，41例为单纯型。单纯型中有：骨转移型18例、肝转移型11例、远处淋巴结转移型1例、肺转移型10例、和脑转移型1例。

　　三、免疫组化

　　全部104例患者均在我院行治疗前活检。取此活检的石蜡包埋标本制成3 μm 切片，常规脱蜡。用鼠抗人单克隆抗体von Willebrand 因子（批号M616, Dako 公司）作为第一抗体进行LSAB法染色（LSAB 试剂盒为Dako公司产品），苏木素复染。一抗的工作浓度为1∶150 。

　　四、计算机图像分析

　　肿瘤血管经免疫组化染色后显示清楚。每例标本先于低倍镜下（×40 和 ×100）找出三个血管密度最高的区域（热点），再将这些区域逐个进行数字图像处理。图像分析系统的分辨度为512×768×12 像素。摄像镜头为Varo Cam 单色CCD镜头（PCO Computer Optics GmbH, 德国），自动图像分析器（Kontron IBAS,德国）使用IBAS软件2.5 版。摄影镜头与Carl Zeiss Axiotro 高分辨率显微镜相接，物镜选用40×0.75 数值孔径。每帧图像所观察到的实际组织面积为27 322 μm² 。图像分析过程是将256 个灰阶的图像转化为二极图像，再计算如下4个参数：每帧图像中的微血管计数、全部微血管占有的相对面积（用百分比表示）、平均血管面积和平均血管周长。其中需手工勾画出血管的轮廓。对于微血管的识别不需具备完整的管腔和红细胞；只要有明显的内皮细胞染色并可与周围的组织分开，就可视为一个独立的血管。最后在每例标本的三帧图像中计算出各血管参数的平均值作为一个标本的测量值。

　　五、 统计学分析

　　全部统计学分析均用SPSS 6.0（社会科学统计软件包）完成。配对t检验用于评价两组的年龄是否具有可比性。单因素和多因素Hotelling t² 检验用于比较两组病例4个血管参数有无差异。多因素ANOVA 用于分析4个参数在单纯型转移和复合型转移病例中的差异，以及在单纯骨转移、肝转移、和肺转移各型间的差异（单纯脑和远处淋巴结转移例数太少，不作比较）。

结果

　　两配对组(转移组和非转移组)的年龄差异无显著性(P=0.065＞0.05)，说明两组的年龄具有可比性。

　　4个血管参数在两配对组中测量的均值结果见表1。其中Hotelling t² 多因素检验的精确F=26.9167，P＜ 0.001，表明四个血管参数综合起来看在两组之间的差异有显著性。单因素检验显示四个血管参数在两组之间差异均有非常显著性，其中微血管计数、平均微血管面积、平均微血管周长、微血管相对面积的t值分别为9.87587、3.30848、7.77972、4.43368，P值分别为 ＜0.00001、0.00173、＜0.00001、0.00005。这显示转移鼻咽癌的微血管个数较多、微血管总体在肿瘤组织中所占有的相对面积较大，但每个微血管的平均面积和平均周长较小。

表1　转移组和非转移组各血管参数的均值(±s)

　　表2显示了4个血管参数在各型转移鼻咽癌中的均值。多因素ANOVA检验表明4个参数在单纯型转移和复合型转移病例中差异无显著性（P＞0.05）；在单纯骨转移、肝转移、和肺转移各型之间差异也无显著性（P＞0.05）。

表2　鼻咽癌不同转移类型各血管参数的均值(±s)

　　讨论

　　除远处转移外，有4个临床因素已被认为是鼻咽癌的预后因素，即年龄、性别、T分期、和N分期^{［1, 2］}。为准确评价肿瘤血管参数与鼻咽癌远处转移的关系，需消除其它干扰因素的影响。为此我们设计了配对研究。其中性别、T分期、和N分期是严格地一对一配对的；同时年龄相差不大于5岁，经检验，两组间统计学上无差异。

　　肿瘤血管系统可部分反映肿瘤血管生成的活跃程度。用多个微血管参数来测量和分析肿瘤血管系统，发现各微血管参数在转移鼻咽癌的与非转移鼻咽癌之间的差异有显著性。已报道,肿瘤血管密度作为测量肿瘤血管生成的一个间接指标，在多种上皮来源的恶性肿瘤中与转移率呈正相关，是有价值的预后指标^{［3, 4］}。近年来，计算机图像分析作为一个较为客观的组织学测量工具已被越来越多地运用于肿瘤血管的测量。借助于计算机图像分析系统，我们对两组共104例鼻咽癌标本的免疫组化切片进行了四个血管参数的测量。结果显示，微血管计数和微血管占有的相对面积转移组高于非转移组；而平均微血管面积和平均微血管周长转移组就低于非转移组。肿瘤血管结构常依不同的解剖部位和不同的宿主而变化^［7,8］。然而，新生的肿瘤血管常在几个方面表现出异常的改变，包括：管腔扩大、囊状改变、窦状改变、血管扭曲，还可形成多个分叉、环襻结构、和芽状盲端^［9］。已有研究显示鼻咽癌肿瘤微血管计数与转移相关^［10］。我们的结果发现，不单微血管计数，而且微血管相对面积在转移组亦高于非转移组；另一方面，平均微血管面积和平均微血管周长在转移组却小于非转移组。这可能是因为转移鼻咽癌的微血管形态异常更加显著，不成型的血管组织更多，单位面积内的血管内皮细胞数目较多而有效的血管腔相对较少。

　　Teo 等^［6］在研究鼻咽癌转移时把鼻咽癌远处转移分成5种单纯型：骨转移型、胸腔内转移型（包括肺和纵隔淋巴结）、肝转移型、远处淋巴结转移型（锁骨以下、纵隔以外的淋巴结）、其它罕见型（包括骨髓、腹膜腔、胰腺、皮肤、以及其它内脏器官和软组织转移）。包含上述2个以上单纯转移型者为复合型。他们报道单纯型的生存期比复合型长；而在单纯型中，胸腔内转移治疗效果最好，生存期最长，可给予积极的综合治疗。然而本研究并未发现肿瘤血管参数在各转移类型之间有什么区别，提示微血管参数不能预测鼻咽癌转移到不同器官的倾向性。

　　Roychowdhury 等^［10］报道肿瘤微血管计数有助于及早识别鼻咽癌转移的高危人群，使针对性的全身治疗可及早与局部和区域的放射治疗综合应用。本研究还发现其它参数，如微血管相对面积、平均面积、平均周长等，也有助于定量分析肿瘤血管特征与远处转移的关系，可望成为预测鼻咽癌远处转移的预后指标。有必要进行前瞻性的、更大样本的随机临床对照研究来进一步证实，并制定出对鼻咽癌血管生成的评价标准，为今后采用血管生成抑制剂来防止鼻咽癌的远处转移提供参考。

参考文献

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(收稿:1997-05-21　　修回:1997-11-10)