肺癌组织中EB病毒致癌相关基因BNLF1检测意义初探
中国肿瘤临床 2000年第1期第27卷 论著选登
作者：彭晓帆 银平章 孔令非 徐继跃 刘政国 王宝梅 赵跃武
单位：彭晓帆（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；银平章（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；孔令非（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；徐继跃（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；刘政国（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；王宝梅（河南省人民医院病理科 郑州市450003）；赵跃武（河南省人民医院病理科 郑州市450003）
许多研究表明Epstein－barr病毒（EBV）感染与鼻咽癌、非洲Buikitt淋巴瘤、霍奇金病 等恶性肿瘤的发生密切相关。近年来，国内外对EBV与肺癌相关性研究渐多，但仍无定论。 笔者采用独立设计引物的PCR方法、限制性酶切分析法等检测肺癌中EBV－BNLF1基因，从基 因水平上对EBV与肺癌关系进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集河南省人民医院和河南省胸科医院40例肺癌手术切除标本。经病理诊断鳞癌26例， 其中高分化2例，中分化12例，低分化12例。腺癌14例，其中高分化2例，中分化4例，低分 化8例。新鲜取材，－80℃冰冻保存。
1.2 标准病毒来源
含有EBV的Raji细胞系由美国国力卫生研究院（NIH）Jackson博士赠送。
1.3 主要试剂与仪器
限制性内切StyI，分子量Marker购自华美公司。Taq酶、4×dNTP购自Promega公司。琼脂 糖购自Sigma公司。PCR扩增仪（PerkinElmerCutes480USA）。德国莱卡3000型冰冻切片机。
1.4 标本制备
取适当大小冰冻组织，冰冻切片、离心、提取消化、提取、沉淀、漂洗、干燥后溶于TE 管中－20℃保存备用。
1.5 对照病毒DNA提取
HCMV，HSV－I，VZV，购自上海第二医科大学，在病毒悬液中加入1％SDS、蛋白酶K、EDT A，42℃水浴过夜。酚—氯仿抽提，得到的病毒DNA溶解在TE中，－20℃备用。
1.6 人基因组DNA制备
参照《Molecularcloning》从血细胞中分离DNA的方法，得到人基因组DNA。用TE稀释－2 0℃保存备用。
1.7 引物
利用电子计算机和一系列引物设计和分析软件，从EBV保守区BNLF1中设计一对引物。敏 感度为fg水平，在Genbank中作同源性检索，与其它序列无显著同源。由上海细胞所用美国A BI－391型DNA合成仪合成。EBV中BNLF1引物序列如下：正链引物P15′ATCCCCAGAAACACGCGTT ACTC3′负链引物P25′GGTACAATGCCTGTCCGTGC3′扩增产物为505bp。
1.8 PCR扩增
10×缓冲液5μl，两种引物各2μl，5mmol/L，4×dNTP2ml，Taq酶2U，模板DNA5μl，去 离子水补足50μl体积，30μl液体石蜡封顶。扩增的反应参数：预变性94℃3分钟；94℃45 秒，55℃50秒，72℃60秒，三温循环，35次：最后72℃延伸7分钟。
1.9 引物特异性测定
用上述PCR扩增体系及反应参数，以标准EB病毒，HCMV，HSV－I，VZV和人基因组DNA为模 板，用去离子水为阴性对照扩增。
1.10 40例肺癌标本扩增
以标准EB病毒为阳性对照，同上扩增。
1.11 结果判定
取10mlPCR扩增产物行2％琼脂糖凝胶中(含EB0.5ml)电泳，紫外投射仪观察。
1.12 产物酶切分析
取PCR扩增产物100ml，加冷无水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇漂洗两次，最后溶解在50ml去 离子水中，加入StyI反应缓冲液及酶中，37℃消化1小时，70℃灭活后，2.5％琼脂糖凝胶电 泳，紫外光下观察和照相。
2 结果
标准EBV可扩增出505bp的靶片段，对HSV－I，HCMV，VZV和人基因组DNA均无扩增产物出 现，说明该引物是特异的(图1)。
40例肺癌标本扩增11例阳性，总阳性率为27.5％（11/40）。其中腺癌阳性率为35％。
产物酶切分析：标准病毒用StyI消化，可产生三条248bp，150bp，107bp靶片段，与计算 机分析结果一致；在11例阳性结果中9例与标准病毒完全相同，被切成三段。有2例仅见到两 条带，分别为398bp、107bp(图2)。
A：分子量标准（1543,994,695,515,237bp）B：标准EB病毒
C：HSV－ID：HCMVE：VZVF：人基因组DNA
G：去离子水阴性对照
图1设计引物对EB病毒的特异性扩增结果
A：分子量标准（1543,994,695,515,377,237bp）
B,D,E,F为阳性标本扩增产物酶切结果
（E、D与EBV酶切结果相同，B、F与标准EBV酶切结果不同）
C：标准病毒扩增产物酶切结果
图2 扩增产物StryI酶切结果
3 小结
本研究通过特异性扩增实验和扩增产物酶切分析实验证明，设计引物是特异的。设计引 物扩增区域为BNLF1片段，它是LMP1蛋白的基因区域。LMP1是重要的转化蛋白，具有肿瘤基 因产物的特性，是EBV致癌的重要物质。因此，用设计EBV－BNLF1引物扩增检测分析癌瘤组 织中EBV感染情况及其致癌关系上比引物扩增其它区域更为直接、更有价值。
40例肺癌组织中EBV－BNLF1DNA扩增结果中，肺鳞癌与肺腺癌阳性率差异有显著性，低分 化肺癌与高中分化肺癌阳性率差异有显著性。这与张雷等报道用PCR方法检测结果一致。对E BV－BNLF1基因片段及其表达产物的检测结果，提示肿瘤组织中EBV－BNLF1基因片段及LMP1 的表达是EBV潜伏感染的一个客观指标，也可能是EBV致癌的关键环节。
笔者对40例中11例阳性标本用StyI进行酶切分析，其中有2例产物特殊，只有两条带，说 明该2例靶片段核酸序列与标准病毒不同。推测可能由于变异所致，变异及其变异情况的确 定有待于核酸序列分析结果。如有变异发生，可能与肺癌的发生机制有关，有待于进一步深 入研究。
收稿1999－03－06
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