人肺癌染色体端粒联合的比较观察
中国肺癌杂志 2000年第2期第3卷 论 著
作者：严军 周宏远 肖林 周清华 吴纯清 赵峰 王允
单位：严军(第三军医大学基础部生物学与细胞生物学教研室)；周宏远 肖林 周清华(610041 成都，华西医科大学附属第一医院肿瘤中心肿瘤研究所)；赵峰 王允(胸心外科)；吴纯清(第三军医大学全军传染病中心)
关键词：肺肿瘤；染色体；端粒联合
【摘要】 目的 探讨人肺癌细胞染色体端粒联合异常的规律。方法 应用染色体制备法检测人肺腺癌细胞株A549细胞、15例肺癌患者外周血淋巴细胞的端粒联合率，并以15例良性疾病和正常人作对照。结果 肺癌组和非癌对照组的端粒联合率存在显著差异(P＜0.005)，人肺腺癌细胞株A549中端粒联合率显著高于肺癌组和非癌对照组(P＜0.005)；肺癌组细胞染色体中B、C、D组的端粒联合率明显高于非癌对照组(B组P＜0.05，C、D组P＜0.005)。结论 与非癌对照组比较，人肺腺癌细胞株A549及肺癌患者外周血淋巴细胞染色体存在着更显著的端粒联合现象，且多发于染色体的B、C、D组，可为肺癌诊断和预后的进一步研究提供有价值的细胞遗传学资料。
Comparison and observation on chromosome telomeric associations in human lung cancer
YAN Jun, ZHOU Hongyuan, XIAO Lin, ZHOU Qinghua, WU Chunqing, ZHAO Feng, WANG Yun. Cancer Center and Cancer Institute, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China
【Abstract】 Objective To explore the regularity of abnormal telomeric associations in cellular chromosome of human lung cancer. Methods The rate of telomeric associations was detected in human lung adenocarcinoma cell line A549, peripheral blood lymphocytes in 15 patients with lung cancer, and in patients with non-cancerous diseases and normal adults as control by chromosome preparation assay. Results A highly significant difference in the rate of telomeric associations was found between lung cancer group and control group (P＜0.005). Human lung adenocarcinoma cell line A549 had the highest rate of telomeric associations in all groups (P＜0.005). Moreover, there was significant difference in the rate of telomeric associations in idiogram B, idiogram C and idiogram D between lung cancer group and control group (idiogram B,P＜0.05; idiogram C, idiogram D, P＜0.005). Conclusion Compared with control group, human lung adenocarcinoma cell line A549 and lung cancer chromosome has higher telomeric associations and most of them occured in idiogram B, idiogram C and idiogram D. It will provide worthwhile data of cell genetics for further research work on early diagnosis and prognosis in human lung cancer.
【Key words】 Lung neoplasms Chromosome Telomeric associations
端粒是真核生物染色体的物理末端结构，由富含G的寡核苷酸DNA重复序列组成。人类染色体端粒平均长度为8～14 kb，核心序列是5'-TTAGGG-3'。它具有维持染色体稳定，防止其不正常降解的功能。细胞遗传学研究显示，端粒功能缺损的染色体(尤其是肿瘤细胞染色体)常常伴随端粒联合(双着丝粒染色体)、减数分裂不稳定等现象。在神经鞘瘤、未分化细胞瘤、脑星型细胞瘤、肾成神经细胞瘤和巨细胞骨瘤等实体瘤以及急性粒细胞白血病中均存在较高的端粒联合率［1～3］，为进一步探讨肿瘤细胞染色体中端粒联合异常的规律性，并鉴于国内目前尚无对人肺癌染色体端粒联合的研究报道，我们对人肺癌细胞株及肺癌患者外周血淋巴细胞染色体的端粒联合进行了比较观察。
1 材料与方法
1.1 材料 包括人肺腺癌细胞株A549和肺癌患者及非癌对照人群的外周血淋巴细胞。人肺腺癌细胞株A549来自第三军医大学新桥医院全军呼吸研究所，肺癌患者外周血来自华西医科大学附属第一医院胸心外科中无遗传病史、未进行过放疗和化疗、病理诊断为肺癌的患者，共15例，其中男性13例，女性2例，平均年龄54.32岁；非癌对照人群外周血来自华西医科大学附属第一医院内科无遗传病史、病情轻微的非肿瘤患者和正常的志愿者，共15例，其中男性11例，女性4例，平均年龄48.87岁。
1.2 方法 所用细胞株复苏后置于小方瓶内(RPMI 1640 ml，小牛血清1 ml)按常规细胞培养方法置37℃ CO2孵箱培养，及时传代和换液。当镜检发现细胞长势旺盛，基本贴满瓶壁时，即加秋水仙胺(10 μg／μl)3～5滴终止培养，2 h后弃去培养液，用0.25％胰蛋白酶液1 ml处理0.5～1 min，弃去后再加入适量培养液反复吹打，将附于瓶壁上的细胞全部移至培养液中。转管后按外周血淋巴细胞染色体制备方法制备人肺癌细胞株染色体，吉姆萨染色。
实验组及对照组采1.5～2 ml外周血，置培养液(RPMI 1640 4 ml，小牛血清1 ml，10 mg／ml的PHA 0.3～0.5 ml，100 IU／ml的肝素钠2或3滴)中培养72 h，终止前2～3 h加秋水仙胺(10 μg／μl)3～5滴终止培养，然后按常规方法制备外周血淋巴细胞染色体，吉姆萨染色。将制备的细胞株及外周血淋巴细胞染色体标本置于油镜(日本产OLYMPUS BHS-313型)下观察(10×100)，记录各组标本中染色体端粒联合次数及其发生端粒联合分裂相数目。并利用显微摄影装置(日本产PM-10AD型)拍照。
端粒联合率＝分裂相中发生端粒联合的总次数／所观察分裂相的总数×100％
端粒联合分裂相比率＝发生端粒联合的分裂相数目／所观察分裂相的总数×100％
1.3 数据处理 对所获得的数据行χ2检验，P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 镜检观察结果 人肺腺癌细胞株A549染色体分裂相多，每个分裂相中染色体数目往往为高异倍体，端粒联合现象明显，有的分裂相中可看到多次端粒联合，并伴有染色体断裂、易位和缺失等现象。肺癌实验组外周血淋巴细胞染色体分裂相数目少于前者，尤其是一些术后不久患者的细胞染色体分裂相更少，端粒联合次数较细胞株少，但多于非癌对照组。非癌对照组外周血淋巴细胞染色体分裂相数目介于细胞株组与肺癌实验组之间，染色体核型正常，偶有端粒联合发生(图1～3)。
图1 人肺腺癌细胞株A549的染色体端粒联合(10×100)
Fig 1 Chromosome telemeric associations in human lung adenocarcinoma cell line A549
图2 肺癌患者外周血淋巴细胞的染色体端粒联合(10×100)
Fig 2 Chromosome telemeric associations in peripheral blood lymphocytes of the patients with lung cancer
图3 非癌对照组外周血淋巴细胞的染色体端粒联合(10×100)
Fig 3 Chromosome telemeric associations in peripheral blood lymphocytes of control patients with non-cancerous diseases
2.2 端粒联合率、端粒联合分裂相比率在肺癌实验组和非癌对照组之间的比较 在细胞株组中挑选100个中期分裂相进行端粒联合率和端粒联合分裂相比率的统计；肺癌实验组和非癌对照组标本中每例各挑选50个中期分裂相进行端粒联合率和端粒联合分裂相比率的统计。共观察了1 600个分裂相，数据结果见表1。肺癌实验组外周血淋巴细胞染色体的端粒联合率和端粒联合分裂相比率高于非癌对照组外周血淋巴细胞染色体的端粒联合率和端粒联合分裂相比率(P＜0.005)。
按染色体分组标准，进一步统计染色体各组中的端粒联合率和端粒联合分裂相比率，并利用χ2检验对同一组别的染色体的端粒联合率和端粒联合分裂相比率进行比较(表2)。统计结果显示a＝0.05时，肺癌实验组细胞染色体中B、C、D组的端粒联合率和端粒联合分裂相比率显著高于相应对应组(B组P＜0.05，C、D组P＜0.005)，而两实验组中A、E、F、G组染色体的端粒联合率和端粒联合分裂相比率之间的差别无统计学意义(A组P＞0.05，E、G组P＞0.1，F组P＞0.25)。
表1 人肺癌染色体端粒联合率及端粒率联合分裂相比率
Tab 1 The rate of telomeric associations and the ratio of division phase of
telomeric associations in chormosome of human lung cancer
| Groups |
No. of division phase |
Times of telomeric
associations |
No. of division phase in
telomeric associations |
The rate of telomeric
associations(％) |
The rate of division phase
in telomeric associations(％) |
| Cell line A549 |
100 |
98 |
58 |
98 |
58 |
| Lung cancer |
750 |
183 |
165 |
24.40 |
22.00 |
| Control |
750 |
117 |
105 |
15.60 |
14.00 |
表2 人肺癌染色体端粒联合率和端粒联合分裂相比率的比较
Tab 2 Comparison between the rate of telomeric associations and the ratio of division phase of
telomeric associations in chromosome idiogram of human lung cancer
| Groups |
No. of division
phase |
Statistical item |
Chromosome idiogram |
| A |
B |
C |
D |
E |
F |
G |
| Lung cancer |
750 |
Times of telomeric associations |
46 |
30 |
134 |
75 |
32 |
15 |
30 |
| |
|
No. of division phase in telomeric associations |
38 |
29 |
107 |
61 |
29 |
14 |
29 |
| |
|
The rate of telomeric associations(％) |
6.13 |
4.00 |
17.87 |
10.00 |
4.27 |
2.00 |
4.00 |
| |
|
The rate of division phase in telomeric associations(％) |
5.06 |
3.87 |
14.27 |
8.13 |
3.87 |
1.87 |
3.87 |
| Control |
750 |
Times in telomeric associations |
28 |
17 |
97 |
32 |
22 |
11 |
19 |
| |
|
No. of division phase intelemeric associations |
25 |
16 |
65 |
29 |
19 |
10 |
19 |
| |
|
The rate of telomeric associations(％) |
3.73 |
2.27 |
12.93 |
4.27 |
2.93 |
1.47 |
2.53 |
| |
|
The rate of division phase in telomeric associations(％) |
3.33 |
2.13 |
8.67 |
3.87 |
2.53 |
1.33 |
2.53 |
3 讨论 在肿瘤细胞染色体中常常存在比正常细胞染色体明显增高的端粒联合率，这已被许多报道所证实。除此之外，Jeffrey等［1］曾描述在神经鞘瘤、脑星型细胞瘤、肾成神经细胞瘤和未分化肝肉瘤等细胞中，发生端粒联合的染色体多发生于11p和4p，又以4p和22q的联合为多，而且10p、21p和22q的联合也不在少数。Karen等［4］发现在脑星型细胞瘤中，端粒联合多发生于18p与21q。Li等［5］则报道在脉络膜丛肿瘤中端粒联合多见于12p和20q。本实验观察了15例肺癌患者和15例非癌对照人群的端粒联合率和端粒联合分裂相比率，得到同样的结果，并且在人类染色体组的B、C、D组中的端粒联合率和端粒联合分裂相比率在肺癌实验组和非癌对照组之间的差异最大(B组P＜0.05，C、D组P＜0.005)，而A、E、F、G组染色体中的端粒联合率和端粒联合分裂相比率在两实验组中的差异无统计学意义(A组P＞0.05，E、G组P＞0.1，F组P＞0.25)。而在人肺腺癌细胞株A549中的端粒联合率和端粒联合分裂相比率则高于前面两实验组(P＜0.05)。
既然端粒具有稳定染色体末端、避免染色体重组和末端被降解以及防止染色体复制时缩短的作用，那么一旦端粒结构发生了变化(特别是癌变)，整个染色体的稳定性就会受到影响。事实上端粒复制中“难题”的存在和“断裂—融合—桥”模型的阐明，导致人类许多体细胞如胚胎肾细胞、T细胞、成纤维细胞、乳腺上皮细胞和子宫颈细胞等的端粒序列每年丢失50～105 bp，而肺癌组织染色体端粒DNA与自身癌旁组织对照实验表明，二者端粒长度的差别有统计学意义(P＜0.05)［6］。这样染色体由此逐渐失去保护的屏障而变得不稳定。这既是细胞衰老和凋亡的机理之一，又与细胞在机体与环境因素共同作用下可能发生的病理变化(特别是癌变)密切相关。其细胞染色体畸变机理可以从“断裂—融合—桥”的模型中得到解释：当两条邻近染色(单)体失去末端的端粒功能时，它们很容易彼此联合，形成双着丝粒染色体。这种结构经有丝分裂一分为二地进入两个子细胞。由于该染色体片段末端无新的端粒形成，故易再次发生类似循环。由此形成的子代染色体不仅遗传信息紊乱，而且末端无端粒形成，其性能更不稳定，病变机率大大增加［7］。这提示细胞染色体畸变程度与细胞病变(特别是癌变)有一定相关性。并可从人肺腺癌细胞株A549、肺癌实验组细胞和非癌对照组细胞染色体中端粒联合率和端粒联合分裂相比率的差异中得到启示。结合端粒结构异常可能导致染色体的其它畸变，如肺鳞癌淋巴结转移灶中的癌细胞染色体结构改变主要发生在1q11、2p11.1和2q11.1三部分，表现为易位、缺失及等臂染色体等［8］，在细胞遗传学水平找到肺癌诊断的参考标准是可能的。
肺癌患者淋巴细胞转化率与其本身的免疫能力有关，即与年龄和病情有关。一般来说，年龄偏大、病情较严重的肺癌患者淋巴细胞转化率低，免疫功能低下，其外周血淋巴细胞的分裂相也就相应减少，这要求实验中适量加大标本量和采血量以及PHA浓度。由于医院提供标本的肺癌患者年龄常常偏大，因此在选择非癌对照组时应克服年龄因素的偏倚。由此看来，针对肺癌患者的年龄、性别、肺癌分期分型情况并结合匹配的非癌对照，对其外周血淋巴细胞的端粒联合率和端粒联合分裂相比率进行观察、比较和统计，找到多发端粒联合的染色体组数和号数，提供有价值的细胞遗传学资料，对于肺癌的诊断和预后是有积极意义的。因此，继续深入开展这方面的工作仍是必要的。
本研究受国家自然科学基金(39570392)资助
参 考 文 献
1，Jeffrey RS, Gary JR, Jane MB, et al. Telomeric associations in the progression of chromosome aberrations in pediatric solid tumors. Cancer Genet Cytogenet,1996,90(1)∶1-13.
2，Erin NM, Sonny LJ, James RN, et al. Chromosomal anomalies exclusive of telomeric associations in giant cell tumor of bone. Cancer Genet Cytogenet,1996,88(2)∶163-166.
3，Shay JW, Werbin H, Wright NE. Telomeres and telomerase in human leukemias. Leukemia,1996,10(5)∶1255-1261.
4，Karen JH, Etela N, Dagmark, et al. Astrocytoma with a unique telomeric associations. Cancer Genet Cytogenet,1994,76(1)∶33-35.
5，Li YS, Fan YS, Ross FA. Endoreduplication and telomeric associations in a choroid plexus carcinoma. Cancer Genet Cytogenet,1996,87(1)∶7-10
6，严军，周宏远，肖林，等.人肺癌染色体端粒行为异常与癌变的关系.四川大学学报(自然科学版)，1998，35(专辑)∶72-75.
7，严军，周宏远.端粒、端粒酶行为异常与癌变关系的研究进展.实用癌症杂志，1998，13(4)∶313-315.
8，莫晓能，陈文彬.端粒、端粒酶与肺癌.国外医学呼吸系统分册，1998，18(1)∶11-13.
(收稿：1999-03-31 修回：1999-04-27)
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