人肺癌端粒酶活性的研究
中国肺癌杂志 2000年第2期第3卷 论 著
作者：崔旭 张京岚 周奕 胡尚基 张京立 高明哲 张洁
单位：崔旭 张京立 张洁 张京岚 周奕 胡尚基 高明哲(首都医科大学附属北京安贞医院)
关键词：肺肿瘤；胸水；端粒酶；多聚酶链反应
【摘要】 目的 探讨端粒酶活性表达与肺癌发生发展的关系。方法 应用PCR-TRAP-银染法检测50例肺癌组织及细胞和20例相应癌旁组织、5例肺结核瘤组织及细胞的端粒酶活性。结果 肺癌组：36例手术切除肺癌组织中端粒酶阳性率为91.7％，7例纤维支气管镜活检肺癌组织和7例癌性胸水细胞中端粒酶阳性例数分别为6例和5例；总检出率为88％(44／50)。对照组：癌旁组织中端粒酶阳性率为10％(2／20)，肺结核瘤组织及细胞的端粒酶表达均呈阴性。将纤支镜活检组织分别进行端粒酶表达和病理检查，发现端粒酶活性检出率(6／7)明显高于病理诊断阳性率(3／7)。结论 端粒酶可作为肺癌诊断的指标之一，检测其在纤维支气管镜活检组织及胸水细胞中的表达可提高肺癌早期诊断率。
Detection of telomerase activity in human lung cancer
CUI Xu, ZHANG Jinglan, ZHOU Yi, HU Shangji, ZHANG Jingli, GAO Mingzhe, ZHANG Jie. Institute of Gerontology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the role of telomerase activity in the oncogenesis and progression of human lung cancer. Methods A total of 50 malignant neoplasm's specimens from patient with lung cancer including 36 surgically resected tissues, 7 fiberobronchoscopically collected tissues or cells, 7 pleural effusion cells and 20 tumor-adjacent tissues and 5 tuberculous tissues or cells were examined for telomerase activity by PCR-based TRAP(telomeric repeat amplification protocol) assay. Results In the lung cancer group, the positive rate of telomerase activity in surgically resected lung cancer tissues was 91.7％(33 out of 36 samples), and 85.7％ (6 out of 7 samples) and 71.4％ (5 out of 7 samples) in fiberobronchoscopically collected tissues or cells and pleural effusion cells, respectively. However, that in the tumor-adjacent tissues was 10％ (2 out of 20 specimens) and no telomerase activity was observed in 5 tuberculous tissues or cells. Positive rate in telomerase activity (85.7％) was significantly higher than that in pathologic assay (42.9％) in the same 7 samples collected through fiberobronchoscope. Conclusion The results suggest that detection of telomerase activity of fiberobronchoscopically collected tissues or cells and pleural effusion cells would be a helpful examination in the diagnosis of patients with lung cancer.
【Key words】 Lung neoplasms Pleural effusion Telomerase Polymerase chain reaction
端粒是真核细胞染色体末端的串链重复DNA序列，其长度与细胞寿命的调控密切相关［1］。端粒酶是具有逆转录酶功能的核糖核蛋白酶，能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，以补偿细胞分裂时端粒的缩短［2］。近年的研究发现，端粒酶与肿瘤关系密切，端粒酶的激活有助于肿瘤细胞无限增殖。我们采用端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)［3］-PCR银染法对肺癌组织及细胞进行端粒酶活性检测，以探讨端粒酶活性与肺癌发生发展关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源 检测标本为手术切除肺组织(36例肺癌组织，20例相应癌旁组织，2例肺结核组织)，纤维支气管镜(简称纤支镜)活检肺组织(7例肺癌，1例肺结核)，胸水细胞(7例癌性，2例结核性)，均来自北京安贞医院1997年11月至1999年9月的住院患者，并经病理学诊断证实。阳性对照为肝癌细胞H22，由解放军总医院临床药理药学实验室提供。所有标本离体后30 min内液氮速冻，于1个月内检测。肺癌分期采用国际抗癌联盟1986年修订的分期标准。
1.2 引物合成 根据文献3，选用TS(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)和CX(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)引物，由中国科学院微生物研究所合成。
1.3 端粒酶提取 ①50 mg手术切除组织，剪碎后用冷PBS洗涤2次，加200 μl裂解液［3］充分研磨；②纤支镜活检组织直接加入50 μl冷裂解液研磨；③20～50 ml胸水经4℃，1500 r／min，离心10 min，细胞沉淀经冷PBS洗2次后，加入200 μl冷裂解液。上述样品混匀后，0℃放置30 min，4℃，13 000 r／min离心10 min，弃沉淀。采用紫外分光光度计进行蛋白质浓度测定，置－80℃冰箱贮存。
1.4 端粒酶活性测定 在Kim法［3］基础上略加改进：25 μl反应体系中含6 μg蛋白提取物，0.5 μg T4基因32蛋白，同时加入TS和CX引物，在PCR仪上30℃，40 min，使TS引物延伸后再进行PCR扩增，PCR产物通过12％不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(120 V，5 h)，凝胶经硝酸银染色甲醛还原后观察结果并照相。端粒酶阳性者为间隔6 bp梯形条带，以≥4条带者计为端粒酶阳性。
1.5 数据处理 采用SPSS软件进行方差分析和χ2检验。
2 结果
2.1 肺癌组织及细胞中端粒酶的表达 图1显示了人肺癌端粒酶活性检测结果。36例手术切除组织中端粒酶阳性者有33例，阳性率为91.7％；纤支镜活检组织中端粒酶阳性率为85.7％(6／7)；胸水细胞中端粒酶阳性率为71.4％(5／7)。20例癌旁组织中有2例端粒酶阳性，阳性率10％；5例肺结核组织和细胞中端粒酶表达均阴性，与肺癌组比较差异均有显著性(P＜0.05)。
2.2 端粒酶检出率与临床病理学参数的关系 由表1可见，端粒酶表达在不同肿瘤大小、组织类型、分化程度和临床分期间无显著性差异(P＞0.05)。以PCR反应产物的电泳条带数判断端粒酶表达强弱，其结果显示：未分化癌有7.67±3.21条带，鳞癌有7.0±4.01条带，腺癌有6.84±4.84条带，三组间差异无显著性(P＞0.05)。
2.3 纤支镜活检组织端粒酶活性检测与病理学诊断结果比较 共分析7份纤支镜活检组织。端粒酶检测阳性率为85.7％(6／7)，明显高于病理学阳性率(42.9％，3／7)(P＜0.05)，二者符合率为57.1％(4／7)，联合阳性率为85.7％(6／7)。病理学诊断阴性者在经手术或经皮肺活检或重复纤支镜检查后被证实为肺癌。
图1 人肺癌端粒酶活性检测结果
1：H22肝癌细胞株；2，7：癌旁组织；3，4：手术切除组织；5：裂解液对照；6：纤支镜活检组织；8，9：胸水细胞
Fig 1 Detection of telomerase activity in human lung cancer
1:H22 hepatic cancer cell line; 2,7: paracancerous tissues; 3,4:surgically resected cancer tissues; 5:lysis buffer control; 6:fiberobronchoscopically collected cancer tissue; 8,9:pleural effusion cells
表1 端粒酶检出率与肺癌病理生理特征的关系
Tab 1 Relationship between telomerase activity and
pathophysiological characteristics of lung cancer
| Characteristics |
No. of cases |
No. of positive cases
(Positive rate) |
| Tumor size |
|
|
| ＜3 cm |
6 |
5(83.3％) |
| ＞3 cm |
44 |
40(90.9％) |
| Pathology |
|
|
| Adenocarcinoma |
21 |
18(85.7％) |
| Squamous cell carcinoma |
25 |
23(92％) |
| Undifferentiated carcinoma |
4 |
4(100％) |
| Differentiation |
|
|
| Low |
20 |
18(90％) |
| Medium |
27 |
24(88.9％) |
| High |
3 |
3(100％) |
| Stage |
|
|
| Ⅰ |
15 |
12(80％) |
| Ⅱ |
9 |
8(88.9％) |
| Ⅲ |
20 |
20(100％) |
| Ⅳ |
6 |
5(83.3％) |
3 讨论 端粒酶被认为是特异的肿瘤标记物，在肿瘤诊断和治疗方面具有良好前景。目前，国际上主要采用TRAP法检测端粒酶活性，我们对此进行了改进，用裂解液直接研磨组织，减少T4基因32蛋白的用量，两个引物同时加入，缩短电泳时间等使实验简单化，节省了开支。研究结果显示，肺癌端粒酶总阳性率为88％(44／50)，癌旁组织阳性率为10％(2／20)，良性病变端粒酶表达阴性，与Shay等［4］和Hiyama等［5］报道的结果类似，其肺癌端粒酶阳性率分别为80％和76.5％，表明端粒酶具有较高的肿瘤表达特异性。对2例端粒酶表达阳性的癌旁组织进行病理学检查，未见癌细胞，我们由此考虑在癌旁组织中存在具有一定增殖活性的细胞，使组织端粒酶活性低表达。对肺癌的临床与病理特征分析结果显示，端粒酶表达与肺癌的组织类型、肿瘤大小、分化程度及临床分期无关。有报道端粒酶活性表达强弱与肿瘤的组织类型和细胞增殖能力有一定相关性［5］，但本实验可能因例数较少，未见明显相关。
端粒酶能否成为肿瘤早期诊断指标，目前尚待进一步研究。我们的研究结果显示Ⅰ期肺癌组织中端粒酶阳性率为80％(12／15)，表明肺癌早期端粒酶即有一定程度表达。纤支镜肺活检病理学检查是明确肺癌诊断的早期有效方法之一，阳性率高达90％，但由于受所取组织块大小及肿瘤生长方式影响，往往需要重复或多次进行。为观察端粒酶在肺癌纤支镜活检组织中的诊断价值，对7例可疑肺癌患者同时进行了病理学和端粒酶表达对比性检测，结果显示，端粒酶表达阳性率(85.7％)明显高于病理诊断率(42.9％)，表明端粒酶对肺癌早期诊断可能有一定的价值。端粒酶阳性率与张行等［6］(91.3％)和陈鲁琦等［7］(83％)报道的结果接近。
胸水的鉴别是肺癌诊断的常见问题。本研究观察了7例癌性及2例结核性胸水细胞，癌性胸水细胞中端粒酶阳性率为71.4％(5／7)，与张伟等［8］的结果(76.7％)相似，而结核性胸水表达阴性，提示端粒酶可做为鉴别癌性胸水的指标，但因例数少，结果有待进一步验证。我们认为，联合检测端粒酶活性和其他肿瘤标志物，有可能提高肺癌的诊断和鉴别诊断。
志谢 北京安贞医院的胡燕生、李昕、高元明、安源为本研究收集了标本，在此一并志谢。
参 考 文 献
1，Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Scientific Am, 1996,274(2)∶80-85.
2，Rhyu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶884-894.
3，Kim NM, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266(5193)∶2011-2015.
4，Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer,1997,33(5)∶787-791.
5，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶895-902.
6，张行，应可净，蔡心涵，等.纤维支气管镜直视下肺刷落细胞端粒酶的检测.中华肿瘤杂志，1998，20(6)∶431-433.
7，陈鲁琦，陈鲁豫，王宁.肺癌支气管肺泡灌洗液细胞端粒酶测定的临床意义.中华结核和呼吸杂志，1998，21(12)∶730-732.
8，张伟，金顺钱，刘毅，等.癌性胸水细胞端粒酶活性研究.癌症，1999，18(1)∶39-41.
(收稿：2000-01-11 修回：2000-04-04)
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