阿霉素诱导肺癌细胞凋亡的实验研究

图1　阿霉素作用A549细胞后各时间点漂浮细胞数 　　Fig 1　Detached cell counting at different time points after treatment with doxorubicin 　　2.2　AO染色荧光显微镜观察　漂浮细胞较正常细胞体积变小，呈桑椹状或梅花状，细胞膜完整，膜上有一处或多处泡状膨出或突起，胞核染色质染为亮黄绿色，染色质浓聚，碎裂为块状或球状，沿细胞核内侧排列，或边集呈新月状，部分浓聚染色质进入细胞质或胞膜泡状膨出内，有的细胞裂解成数个细胞膜完整的小体，内含浓聚染色质(图2)。

图2　AO染色凋亡细胞形态(×40) 　　Fig 2　Apoptosic cells stained with acridine orange(×40) 　　2.3　电镜观察　扫描电镜下见细胞膜表面微绒毛消失，细胞皱缩或有泡状突起。透射电镜下见绝大多数细胞膜完整，细胞质内细胞器基本正常，染色质浓聚，沿核膜内侧边集(图3)，部分细胞呈放射状崩裂，形成许多细胞小体，细胞小体内含点状浓聚染色质及正常细胞器，其胞膜完整。

图3　凋亡细胞染色质边集(×5 000) 　　Fig 3　Chromatin margination of apoptotic cells(×5 000) 　　2.4　细胞DNA电泳　DNA电泳带呈梯状，产生180～200bp片段(图4)。

图4　细胞DNA琼脂糖电泳显示DNA电泳带呈梯状 　　Fig 4　DNA ladder at agarose gel electrophoresis 　　2.5　流式细胞仪检测　撤药后10h收集的贴壁细胞在G1期前出现一个陡立的凋亡峰，占细胞总数5.5%。 　　3　讨　论 　　3.1　肺癌细胞凋亡模型的成功建立　确定细胞凋亡主要依据形态学及生物化学特征［3］。本实验形态学观察发现细胞体积缩小，胞膜皱折起泡，胞膜完整，细胞质内细胞器正常，胞核染色质浓聚，边集，细胞核碎裂为多个嗜锇性团块，进入细胞质及膜小泡中，细胞小泡可脱离细胞，细胞裂解为多个包膜完整、内含浓聚染色质团块的小体，这些形态学表现符合细胞凋亡的特征。锥虫蓝染色是鉴别细胞膜完整性的方法，以阿霉素作用过的肺癌细胞进行锥虫蓝排斥试验发现拒染，说明细胞膜的通透功能没有受到明显破坏，细胞膜在细胞受处理过程中保持了功能完整性，符合凋亡细胞膜的特征。 细胞DNA电泳带呈梯状，基因组DNA被切割为180～200bp的不连续片段，说明核酸内切酶已被激活，符合细胞凋亡的生物化学标准。 Darzynkiewice 等［4］总结了凋亡细胞的流式细胞仪检测特征。本实验流式细胞仪检测结果经电脑软件分析亦说明G1期细胞峰前存在一小群细胞(占5.5%)，其特征符合凋亡的特征，说明在此条件下阿霉素已诱导A549细胞凋亡。 　　3.2　凋亡细胞动力学　Evans等［5］以顺铂诱导肝癌细胞凋亡，发现贴壁细胞中凋亡细胞只占1%～4%，而漂浮细胞中凋亡占62%。我们以贴壁细胞行流式细胞仪分析的结果与此相近，贴壁细胞中凋亡细胞只占5.5%，因此，后来对凋亡细胞的研究主要集中于漂浮细胞。虽然漂浮细胞中也存在一定比例的坏死细胞及细胞碎片，但是短时间内漂浮细胞数量改变主要反映了凋亡细胞数目的变化。我们以漂浮细胞数量绘制曲线，目的就是希望找出短时间内产生较多凋亡细胞的时间点，为今后的研究打下基础。绘制的曲线呈S型，撤药以后培养6～12h内凋亡细胞急剧增多，12h产生凋亡细胞的速度明显减慢。出现这种现象的原因是多方面的，由于加药前采取了细胞同步化，这样细胞对药物的反应就更趋向一致，因此可以在短时间段内诱导出大量凋亡细胞。在相同条件下部分A549细胞出现凋亡，但是却还有一部分细胞贴壁存活，这可能是所用的阿霉素的杀伤强度不十分强烈及肿瘤细胞异质性造成的。 　　总之，我们以20μmol/L阿霉素处理A549细胞，成功地诱导A549细胞发生凋亡。凋亡细胞主要存在于漂浮细胞中。在药物作用撤除10～12h后可以得到较大量凋亡细胞。该实验为今后细胞凋亡实验研究打下一定基础。 　　作者单位：穆峰　蔡瑞君　第二军医大学军医系1985届毕业生,第一军医大学南方医院胸心外科, 　　广州,510515 　　金吴东　第一军医大学南方医院放疗科 　　穆峰,男1962年6月生,博士主治医师 　　参 考 文 献 　　[1]　Marx J. Cell death studies yield cancer clues. Science, 1993, 259(5096): 760 　　[2]　鄂　征. 组织培养技术. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1993. 258 　　[3]　Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer thepapy. Cancer, 1994, 73(8): 2013 　　[4]　Darzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry, 1992, 13(8): 795 　　[5]　Evans DL, Dive C. Effects of cisplatin on the induction of apoptosis in proliferating hepatoma cells and nonproliferating immature thymocytes. Cancer Res, 1993, 53(9): 2133