GM-CSF对肺癌细胞凋亡及肺泡巨噬细胞抗肿瘤功能的影响
癌症1999年第18卷第2期
胡成平 唐发清△ 李固本
摘 要 目的：了解GM-CSF对肺癌细胞的杀伤作用以及对其调亡和对AM抗肿瘤功能的影响。方法：MTT观察GM-CSF对人肺腺癌细胞株(A549)细胞的杀伤作用以及对肺癌患者AM杀伤A549细胞的影响。透射电镜、凝胶电泳及片段裂解率观察经GM-CSF作用的A549细胞凋亡情况。镀铜镉还原法、放免法、比色法分别检测AM培养上清中NO、TNFα、SOD活性，并用RT-PCR检测AM iNOS mRNA表达。结果：GM-CSF对A549细胞有一定杀伤作用，并呈浓度依赖性。A549细胞核扭曲断裂，凋亡小体形成，DNA凝胶电泳可见梯状条带。AM经GM-CSF刺激后对A549细胞的杀伤率由14.35％增加至43.52％(P＜0.001)，其培养上清液中NO、TNFα的水平显著升高，AM iNOS mRNA表达明显增强。结论：GM-CSF可诱导A549细胞凋亡，刺激肺癌患者AM抗肿瘤功能增强。
关键词：肺肿瘤 肺泡巨噬细胞 粒－巨细胞集落刺激因子 细胞凋亡 基因
粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是近十年研究的热门细胞因子，重点已集中在抗肿瘤作用及其机理方面。国外研究发现GM-CSF具有一定的免疫调节和抗肿瘤作用[1]，但其机理尚未完全阐明，而国内有关报道不多。本研究应用GMSCF体外作用于人肺腺癌细胞株(A549)细胞和肺癌患者肺泡巨噬细胞(AM)，观察其对A549细胞的杀伤效应以及对AM抗肿瘤免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)为厦门特宝生物工程公司产品。A549细胞，由本校肿瘤研究所提供。AM从我院病理证实为肺癌的患者肺泡灌洗液中分离纯化获取。RNA提取试剂盒GIBCo公司产品。逆转录试剂盒Promega公司产品。
1.2 GM-CSF对A549细胞杀伤活性检测
用MTT法[2]检测不同浓度的GM-CSF(10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L)对A549细胞杀伤效应。以化疗药物足叶乙甙(VP16)为阳性对照，测每孔A570nm值，计算杀伤率。
1.3 GM-CSF诱导A549细胞凋亡
1.3.1 形态：收集经GM-CSF处理及对照组A549细胞，用2.5％戊二醛前固定，PBS清洗，2％锇酸后固定，丙酮乙醇梯度脱水、制片，再以醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察。
1.3.2 凋亡细胞梯状DNA分离：收集上述细胞按文献[3]处理后以2％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3.3 DNA定量分析：A549细胞按上述方法裂解后再经文献[4]方法处理，最终计算凋亡细胞DNA裂解率。
1.4 GM-CSF对AM杀伤A549细胞活性的影响
采用MTT法，AM与A549之比为20∶1。共设四组即空白对照组(仅含A549细胞)、阴性对照组(含AM和A549细胞)、GM-CSF组(含AM、A549和GM-CSF 1000μg/L)和阳性对照组(含AM、A549和大肠杆菌脂多糖，LPS)，计算每组被杀伤A549细胞百分率。
1.5 GM-CSF对AM产生细胞毒效应分子的影响
取等量(2×106个)纯化的AM进行配对试验。实验组加GM-CSF，对照组加等体积Hank's液，37℃，5％CO2培养24小时后收集上清测一氧化氮(NO，镀铜镉还原法[5])，肿瘤坏死因子α(TNFα，放免法[6])、超氧化物歧化酶(SOD，比色法)活性。AM液氮冻存待检。
1.6 GM-CSF对AM诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响
AM总RNA提取及cDNA合成分别按相应试剂盒说明书操作。iNOS引物序列见文献[7]，内对照选用β-actin。PCR反应总体积50μl，cDNA0.2μg，10×Buffer5μl,0.2mmol/LdNTPs、两对引物各50pmol/L，2.5UTaq酶。94℃60秒、60℃60秒，72℃90秒，35个循环。阳性样品在2％琼脂糖凝胶电泳上呈现2条带，阴性样品仅见内对照带。阳性样品再经全自动密度扫描仪进行定量分析。
1.7 统计学处理
全部数据输入电脑经SSPS/PC＋软件分析。分别用方差、t检验及χ2检验分析GM-CSF对A549细胞的杀伤效应、对AM杀伤A549细胞以及产生细胞毒效应分子的影响和AMiNOSmRNA表达阳性率及强度。
2 结果
2.1 GM-CSF对A549细胞的细胞毒效应
不同浓度的GM-CSF对A549细胞均有一定的杀伤作用，且随着GM-CSF剂量增加，其杀伤率也随之增强(表1)，两者呈正相关，r=0.7858，P＜0.001。Vp16杀伤率为50%，与GM-CSF各组比较均为P＜0.05。
表1 GM-CSF对A549细胞的杀伤效应(
±s)
| GM-CSF浓度(μg/L) |
n组 |
A值 |
杀伤率(％) |
| 0 |
15 |
0.52±0.08 |
|
| 10 |
15 |
0.40±0.06 |
23.08±5.12 |
| 50 |
15 |
0.37±0.06 |
28.85±4.59 |
| 100 |
15 |
0.35±0.02 |
32.69±1.82 |
| 500 |
15 |
0.34±0.02 |
34.62±1.78 |
| 1000 |
15 |
0.33±0.03 |
36.54±2.76 |
2.2 A549细胞凋亡改变
2.2.1 形态:透射电镜下可见细胞核扭曲断裂成碎块，遍布胞质及细胞突起内。细胞突起与细胞分离形成有包膜包绕的含有染色质块及细胞成份的凋亡小体(见图1)。
图1 透射电镜下观察A549细胞，A：未经GM-CSF处理
b：经GM-CSF处理(100μg/L)
2.2.2 生化改变:凋亡的A549细胞DNA片段经凝胶电泳可见细胞凋亡特有的“梯状”条带(图2)。
图2 经GM-CSF处理的A549细胞DNA片段凝胶电泳结果。
可见细胞凋亡特有的梯状条带，1～6分别经0，10，50，100，500，
1000μg/L浓度的GM-CSF作用结果；M为DNA参照物。
2.2.3 DNA断裂百分率：GM-CSF用量为10μg/L、50μg/L、100μg/L时，DNA裂解率分别为41.66％、44.86％、42.70％，与对照组(39.83％)相比无明显差异(均为P＞0.05)。当用量为500μg/L和1000μg/L时DNA裂解率升至49.78％和51.28％，明显高于对照组(均为P＜0.05)。
2.3 NO、TNFα、SOD活性
由表2可以看出经GM-CSF刺激24小时后，肺癌患者AM培养上清中NO和TNFα水平明显高于未刺激组，但SOD活性无论刺激与否其差异无显著性。(详见表2)
表2 GM-CSF对肺癌患者AM产生细胞毒效应分子的影响(±s)
| 分组 |
n |
NO
(nmol/L) |
TNF
(ng/ml) |
SOD
(U/ml) |
| 未刺激组 |
22 |
63.37±17.58 |
1.32±0.47 |
86.16±17.74 |
| GM-CSF刺激组 |
22 |
85.06±11.22 |
1.98±0.46 |
98.72±24.61 |
| P值 |
|
＜0.001 |
＜0.01 |
＞0.05 |
2.4 AM杀伤A549细胞效应
肺癌患者AM经GM-CSF刺激后对A549细胞的杀伤率由14.35％(未刺激)提高到43.52％，其差异有高度显著性(P＜0.001)； 而GM-CSF与LPS(41.59％)两种不同刺激组杀伤率则无显著差异(P＞0.05)。
2.5 AM iNOS mRNA表达
经GM-CSF刺激后肺癌患者AMiNOSmRNA表达阳性率与对照组无显著性差异(P＞0.05)，但其表达强度明显高于未刺激组(P＜0.05)，见表3。
表3 GM-CSF对肺癌患者AM iNOS mRNA表达影响
| 分组 |
n |
阳性率(％) |
表达强度％(±s) |
| 未刺激组 |
13 |
9(69.23) |
16.85±7.58 |
| GM-CSF刺激组 |
13 |
11(84.62) |
33.38±8.21 |
| P值 |
|
＞0.05 |
＜0.05 |
3 讨论 GM-CSF对某些实体瘤细胞具有杀伤作用已被许多实验证实[8，9]。本研究结果显示不同浓度的GM-CSF对A549细胞均有杀伤作用，并呈剂量依赖性方式。尽管其杀伤效力不及化疗药物VP16，但作为细胞因子仍具有十分重要的临床价值。
GM-CSF对肿瘤的杀伤机制目前尚不甚清楚。我们在研究中发现，经GM-CSF处理的A549细胞出现典型的细胞凋亡形态改变，进一步研究与之相应的生化基础，显示有DNA梯状物形成，提示GM-CSF对A549细胞有诱导凋亡之作用。由此推测，GM-CSF对肿瘤细胞杀伤效应除细胞溶解[10]、增殖抑制[11]作用外，还可能与诱导凋亡有关。
巨噬细胞杀肿瘤的重要方式是分泌NO、TNF、H2O2等多种细胞毒效应分子。H2O2的形成必需SOD催化，因此，检测肺癌患者AM产生NO、TNF、SOD活性高低在一定程度上反映肺癌患者抗肿瘤免疫功能的强弱。本研究显示，肺癌患者AM经GM-CSF刺激后iNOS表达增强，其培养上清液中NO、TNFα水平明显升高，说明AM抗肿瘤活性可被GM-CSF刺激而增强；SOD活性升高无统计学意义，提示GM-CSF刺激AM产生各种效应分子的能力具有不均一性。
作者单位：湖南医科大学附属湘雅医院呼吸科，△中心实验室(长沙，410008)
参考文献
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