饮茶对大鼠大肠变性隐窝病灶及大肠肿瘤的影响

卫生研究 2000年第1期第29卷 论　著

作者：贾旭东　王伟　崔文明　韩驰

单位：贾旭东（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）；王伟（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）；崔文明（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）；韩驰（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京　100050）

关键词：茶；变性隐窝病灶；大肠肿瘤

　　摘要：以二甲基肼诱发Wistar大鼠大肠癌为模型，研究了绿茶和茶色素(红茶的主要成分)大肠癌的化学预防作用和对大肠肿瘤的影响。结果表明，在第16周2个饮茶组动物的变性隐窝病灶(ACF)形成数比阳性对照组显著减少(P＜0.01)；在第32周时阳性对照组100%发生了肿瘤(平均瘤数为2.6个/只，平均瘤体积为294.7mm³/瘤)。绿茶组和茶色素组的平均瘤数抑制率分别为47.1%和43.1%，平均瘤体积抑制率分别为77.1%和68.1%。表明绿茶和茶色素对实验性大肠肿瘤具有预防作用，ACF作为一个有用的中间终点可代替癌发生率进行大肠癌化学预防剂研究。

　　中图分类号：R739.85　TS272.2　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8020(2000)01-0054-03

Effects of tea on aberrant crypt foci and colorectal tumors in rats

Jia Xudong, Wang Wei, Cui Wenming,Han Chi

　　（Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing　100050, China）

　　Abstract：The present study was designed to investigate the chemopreventive effects of green tea and tea pigments(the main component of black tea)on 1,2-dimethylhydrazine(DMH)-induced rat colorectal carcinogenesis.Compared with the positive control group,green tea and tea pigments groups had less numbers of aberrant crypt foci(ACF)(P＜0.01)at the end of week 16.At the end of week 32,all rats in the positive control group developed colorectal tumors with an average of 2.6 tumors per rat,and a mean volume of 294.7mm³ per tumor,while in the groups drinking green tea and tea pigments,the average numbers of colorectal tumors per rat were only 47.1% and 43.1% of controls respectively,and the mean tumor volume was inhibited by 77.1% and 68.1% respectively.It was concluded that tea pigments had a chemopreventive effect on colorectal tumor and ACF formation can be used as a useful intermediate end point to study chemopreventive effects on colorectal cancer.

　　Key words：tea, aberrant crypt foci, colorectal tumor

　　茶是世界上最受人们推崇的无酒精饮料之一，大量研究表明茶叶具有抗突变和抗癌作用。本研究应用二甲基肼诱发Wistar大鼠大肠癌模型来观察茶对癌前病变变性隐窝病灶(aberrant crypt foci,ACF)和对大肠肿瘤的影响，并将二者进行比较，以期能为大肠癌化学预防剂的研究和筛选提供有价值的依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验动物　雄性断乳Wistar大鼠(合格证号：医动字第01-3008号)由中国医学科学院动物中心提供，饲以动物中心提供的常备饲料。

　　1.1.2　主要试剂　绿茶(杭州炒青)、茶色素(纯度约40%，是茶多酚的氧化产物)由中国农业科学院茶叶科学研究所提供；二甲基肼(DMH)(Sigma公司)；美蓝。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物分组及处理　112只雄性Wistar大鼠(5周龄)，平均体重69.7g(59～81g)。在动物房温度为(24±1)℃和相对湿度为(50±10)%的条件下饲养，喂以常备饲料。大鼠在动物房适应1周后，随机分为4组(阳性对照组、绿茶水组、茶色素组、阴性对照组)每组28只。阳性对照组从实验第2周开始颈部皮下注射二甲基肼(DMH)2ml/kgBW，每周1次，连续10周。准确称取DMH，溶于1mmol/L EDTA中，用1mol/L NaOH调pH值至7.0，现用现配。绿茶组和茶色素组于注射DMH前2周开始分别饮用20g/L绿茶水和1g/L茶色素溶液，直至实验结束。绿茶水为2g绿茶溶于100ml沸水中，浸泡半小时，用纱布过滤。茶色素溶液按1g/L浓度直接溶于自来水，每天新鲜配制。阴性对照组颈部皮下注射相同剂量的EDTA。阳性对照组和阴性对照组饮用自来水。整个实验期间，每天观察动物一般情况，记录各组大鼠饮水或饮茶量。注射DMH期间每周称一次体重以调整DMH用量。以后每4周称一次体重。分别于实验第16周和32周断头处死大鼠，取出大肠组织以测定指标。

　　1.2.2　变性隐窝病灶(ACF)观察　于实验第16周，每组处死8只大鼠，参照Bird的方法固定标本和染色^［1］：动物处死后立即分离大肠，用生理盐水冲洗肠内容物，将整根大肠铺平夹于两层滤纸之间，固定于100ml/L中性缓冲福尔马林溶液中，至少24h。固定好的标本用2g/L美蓝染色3～5分钟，立即在×40或×100光学显微镜下观察并计数ACF数目。除了计数整根大肠ACF总数外，还根据每个ACF含有的变性隐窝(AC)数目分为以下三类：小ACF：含有1～3个AC；中ACF：含有4～6个AC；大ACF：含有7个以上AC^［2］。

　　1.2.3　大肠肿瘤发生情况　于实验第32周，每组断头处死20只大鼠，迅速打开腹腔，分离出整根大肠，纵向剖开，用生理盐水冲洗肠内容物，展开铺于玻璃板上，除计算每只大鼠大肠瘤数目外，还用游标卡尺测量每个瘤的长(L)、宽(W)、高(H)，计算瘤体积(V=L×W×H×π/6)，单位mm³。

　　1.2.4　病理组织学观察　上述大鼠大肠组织取材参考耿宝琴等的方法^［3］，将大肠纵向剖开，生理盐水冲洗肠内容物。取靠近直肠端4cm和盲肠端4cm两段组织，经福尔马林固定后，梯度酒精脱水，石蜡包埋，常规石蜡切片(5μm)。2张切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，进行常规HE染色。病理改变分异型增生和癌，出现明显肿瘤细胞病理改变者记录为癌。异型增生分级标准参考Morson等的方法^［4］。光学显微镜下盲法观察其病理改变，最后请专家复审。

　　2　结果

　　2.1　动物体重及饮茶(水)量

　　阳性对照组(DMH)及各试验组动物体重在第16周、32周均不同程度低于阴性对照组(EDTA)，但均无显著性差异(见表1)。此外，2个饮茶组的每天饮茶量与对照组饮水量比较无显著性差异。在整个试验期间，各组动物一般状况良好，无一动物死亡。

表1　各组动物体重变化(±s,n=20)

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　　2.2　大肠癌前病变　　于实验第16周末，检查从肛门至回盲部整根大肠的ACF数(见表2)。阳性对照组(DMH)及2个饮茶组都出现ACF，而阴性对照组则未发现ACF。与阳性对照组相比，绿茶和茶色素组的ACF数均显著减少(P＜0.01)，与茶色素相比，绿茶对ACF的抑制效果较好；小ACF、中ACF和大ACF数目在2个饮茶组中也显著减少(P＜0.01)。

表2　饮茶对DMH诱发大鼠大肠癌前病变ACF的影响(±s,n=8)

　　注：(1)与DMH组比较，经t检验，P＜0.012.3　大肠肿瘤发生率和组织病理学变化

　　至第32周实验结束时，阳性对照组大鼠全部发生大肠肿瘤；平均瘤数目和平均瘤体积分别为2.6个/只和294.7mm³/瘤，而阴性对照组无一只动物发生肿瘤(见表3)。注射DMH并饮绿茶或茶色素的动物，平均瘤数的抑制率分别为47.1%和43.1%，平均瘤体积的抑制率分别为77.1%和68.1%(P＜0.01)。

　　组织病理变化如表4所示，阳性对照组，随着时间增加，病变程度加重，在第32周时，100%大鼠均发生大肠癌。在DMH致癌的不同时期，各饮茶组的组织异常增生程度及癌发生率均有一定程度的降低(P＜0.05)。

表3　饮茶对DMH诱发大鼠大肠肿瘤发生的影响(n=20)

　　注：与DMH组比较，(1)经t检验，P＜0.01　　(2)经Wilcoxon检验，P＜0.01

表4　饮茶对DMH诱发大鼠大肠粘膜组织病理变化的影响(n=8)

　　注：(1)与DMH组比较，经Wilcoxon检验，P＜0.053　讨论

　　Bird于1987年发现致癌剂处理过的小鼠大肠隐窝发生了异常改变，形成灶状结构，与正常隐窝相比，灶内的隐窝体积更大、上皮细胞层次更多、隐窝外周有更大的空间。Bird将其命名为变性隐窝病灶(aberrant crypt foci,ACF)，并提出ACF是大肠癌癌前病变的假设^［1］。许多学者对ACF进行了大量的研究发现：在动物实验中，ACF仅出现在致癌剂处理过的大肠组织中^［5］；ACF的形成与致癌剂呈剂量-效应关系，并且在有的ACF中有异常增生(dysplasia)——癌前病变所具有的细胞学特征^［6］；能抑制大肠肿瘤的化学预防剂也抑制了ACF的形成^［7］；在ACF中观察到大肠癌发生过程中的一些遗传学变化，如K-ras突变和c-fos的扩增等^［8］；在大肠癌病人的组织中也发现了ACF，并且其数量和形态与大肠癌危险性密切相关^［9］。所有这些证据都表明ACF是大肠癌的癌前病变。本研究正是在上述研究结果的基础上，建立了大鼠大肠癌癌前病变模型。结果表明与阳性对照组相比，绿茶组和茶色素组大鼠ACF数量显著减少。

　　茶叶是一种被人们广泛接受的饮品，流行病学资料显示茶叶与大肠肿瘤的发生具有相关性^［10］。Narisawa等在甲基亚硝基脲(MNU)诱发的大鼠结肠癌模型中发现即使给大鼠饮很低浓度的茶多酚(0.002%)也可使其结肠肿瘤发生率下降34%^［11］。Yamane等研究了茶多酚对氧化偶氮甲烷(AOM)诱发的大鼠结肠癌的影响，观察到分别饮用0.01%和0.1%茶多酚的2组大鼠的抑癌率分别为39.2%和29.7%^［12］。本研究得到了相似的结果，即绿茶抑制了大鼠大肠肿瘤的发生，表现为平均瘤数目减少、平均瘤体积降低。此外，我们还观察到红茶的主要成分茶色素对大鼠大肠肿瘤也有抑制作用。

　　本研究结果表明，饮茶抑制了ACF的形成，并最终减少了大肠肿瘤的发生；而且，比较2个模型不难发现，癌前病变模型具有周期短、投资少、方法简单可靠的优点。因此，ACF可以作为一个有价值的中间终点代替癌发生率来研究对大肠癌的化学预防剂。

　　(致谢：感谢中国农业科学院茶叶科学研究所提供茶样品。)

　　作者简介：贾旭东，男，硕士

　　参考文献

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　　3，耿宝琴.动物大肠癌模型.郭鹞主编，人类疾病的动物模型(第2辑).北京：人民卫生出版社，1990，65—72

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　　10，Kato I,Tominaga S,Matsura A,et al.A comparative case-control study of colorectal cancer and adenoma.Jpn J Cancer Res,1990,81:1101

　　11，Yamane T,Hagiwara N,Tateishi M,et al.Inhibition of azoxymethane-induced colon carcinogenesis in rat by green tea polyphenol fraction.Jpn J Cancer Res,1991,82:1336—1339

　　12，Narisawa T,Fukaura Y.A very low dose of green tea polyphenols in drinking water prevents N-methyl-N-nitrosourea-induced colon carcinogenesis in F334 rats.Jpn J Cancer Res,1993,84:1007—1009

(1999-09-27收稿)