Gd标记抗人大肠癌单克隆抗体CL-3对裸鼠肿瘤模型MRI诊断的实验研究

中华放射学杂志 1998年第6期第32卷 *实验研究*

作者：王劲武　黄其鎏　许乙凯　朱正兵　冯文兰

单位：510515广州,第一军医大学南方医院影像中心(王劲武现在610083成都军区总医院放射科)

关键词：磁共振成像；抗体,单克隆；肿瘤,实验性；造影剂

　　【摘要】　目的　(1)探索磁共振成像 ( MRI) 造影剂标记单克隆抗体(McAb)的条件；(2)观察肿瘤特异性MRI造影剂Gd-DTPA-McAb 对肿瘤组织的增强效果。方法　给9只10周龄BALB/c裸鼠皮下注射LS-174T大肠癌细胞以制作肿瘤的动物模型，将CL-3单克隆抗体与DTPA 环二酸酐(c.DTPA)相偶联,再加入钆即得到Gd-DTPA-McAb。观察肿瘤组织在Gd-DTPA-McAb增强后的信号强度变化。结果　(1)当pH=8.0,C/P(c.DTPA与抗体的摩尔比)=1，CL-3浓度=10mg/ml时，c.DTPA与抗体的偶联率最高，达68.2%。(2) Gd-DTPA及Gd-DTPA-McAb对肿瘤组织均有明显的强化作用，两者的区别在于：前者的强化是非特异性的, 而后者的强化则具有肿瘤特异性。结论　靶向MRI(Gd-DTPA-McAb)为早期无创、 定位定性诊断结肠癌(包括其他肿瘤)及其转移灶的显示提供了可行的方法 。

　　Experimental study on gadolinium labeled anti-human colonic carcinoma antibody CL-3 for magnetic resonance imaging diagnosis in nude mice with LS-174T cancer　　Wang Jinwu^*，Huang Qiliu， Xu Yikai， et al. Department of Radiology, Nanfang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510515 (^*Department of Radiology,General Hospital of Chengdu Military District of PLA, Chengdu 610083)

　　【Abstract】　Purpose　The aims of this study were:(1)To find out the optimal measures for the conjugation of gadolinium and monoclonal antibody;(2)To observe the contrast enhancement effect of tissue-specificity with MRI contrast medium-McAb(gadolinium-DTPA-McAb). Methods　Nine nude mice were used as animal models by subcutaneous injection of LS-174T cell.DTPA anhydride and CL-3 monoclonal antibody were first conjugated.Then,gadolinium-acetate was added to label DTPA-McAb and gadolinium-DTPA-McAb was thus available. MRI was performed with a Bruker/Spectrospin Tomikon BMT 1100 MRI system.The enhancing effect of Gd-DTPA-McAb was compared with that of Gd-DTPA. Results　(1) The optimal measures of the conjugation of DTPA anhydride and monoclonal antibody were as follows:pH＝8.0,DTPA anhydride/antibody＝1,CL-3＝10mg/ml.The optimal conjugate rate was 68.2%. (2)Both Gd-DTPA-McAb and Gd-DTPA showed significant enhancement effect in nude mice with LS-174T cancer. The enhancement effect of Gd-DTPA-McAb was tumor-specific,while thaf of Gd-DTPA was not(non-specific).Conclusion　Targeting MRI (Gd-DTPA-McAb) is probably a feasible and promising modality in the early detection of colon cancer (as well as other cancers) and their metastatises.

　　【Key words】　Magnetic resonance imaging　　Antibodies, monoclonal　　Neoplasms, experimentalContrast media

　　MRI靶向诊断的原理与放射免疫显像的原理相似，只是标记的是MRI造影剂，Gd-DTPA标记单克隆抗体(Gd-DTPA-McAb)对肿瘤模型的增强效果国外有少量文献报道^［1～4］。MRI靶向诊断的优点是：无创伤、无辐射,可对肿瘤进行定位、定性诊断。对体腔深部的淋巴结是否有转移，肿瘤术后有否残余和(或)复发也能作出肯定的回答。笔者以CL-3单克隆抗体为引导剂，以钆(Gd)为造影剂对裸鼠肿瘤(LS-174T大肠癌)模型的MRI诊断进行实验研究。旨在探索Gd标记McAb的条件及影响标记率的因素，观察Gd-DTPA-McAb对肿瘤模型的增强效果。

材料与方法

　　实验所用的主要试剂有：DTPA环二酸酐(c.DTPA)、三氧化二钆(Gd₂O₃，纯度99.99%)、钆喷酸葡胺注射液(Gd-DTPA)、CL-3单克隆抗体。细胞及动物有：LS-174T人大肠癌细胞、10周龄BALB/c裸鼠9只。主要设备有： Bruker/Spectrospin公司生产的Tomikon-BMT-1100型MRI扫描仪，最大场强为0.282T，MR-600型酶联检测仪，MPS-2000型紫外分光光度计。

　　肿瘤模型的建立：给每只BALB/c裸鼠背部皮下注射LS-174T人大肠癌细胞5×10⁶个，20天后肿瘤直径为1cm左右。

　　将CL-3单克隆抗体用离心超滤法更换成不同pH值的0.1N的NaHCO₃介质，加入适量c.DTAP(浓度为0.4mg/ml)，混匀后在室温下放置5分钟,偶联反应即告完成。在偶联过程中，c.DTAP一部分与抗体发生偶联反应，另一部分水解为游离的DTPA，与抗体发生偶联反应的c.DTAP占总投入量的百分数叫偶联率。用离心超滤法除去体系中的游离DTPA,并更换成pH 5.6,0.1N醋酸(HAc)介质，再加入GdAc₃，反应后除去未结合的Gd。

　　MRI扫描：选用人膝关节线圈，每只荷瘤裸鼠均作平扫、Gd-DTPA增强扫描、注射Gd-DTPA-McAb后20小时扫描。均作T₁加权横断面及肿瘤最大斜切面成像。TR 500毫秒,TE 34毫秒,矩阵256×256,成像野180mm×180mm。造影剂剂量分别是：Gd-DTPA 5μl含Gd 0.5mg，Gd-DTPA-McAb 0.3ml含Gd 0.04mg、McAb 3mg。

　　统计学处理：方差分析及其两两比较。

结果

　　一、c.DTPA与抗体偶联的最佳条件

　　pH为8.0，C/P（c.DTPA与抗体的摩尔比）=1，抗体浓度为10mg/ml时c.DTPA 与抗体的偶联率最高，达68.2%。CL-3单克隆抗体的免疫学活性因DTPA 的偶联而有降低，但幅度不大。CL-3单克隆抗体偶联DTPA前后的免疫学活性见表1。

　　二、Gd-DTPA-McAb及Gd-DTPA对肿瘤组织的增强效果的比较

　　1. 肿瘤组织增强前(简称A组)、Gd-DTPA增强后(简称B组)及Gd-DTPA-McAb增强后(简称C组)的T₁加权像(T₁WI)的信号强度见表2。

　　方差分析结果：F=68.9，P＜0.01，Student-Newman-Keuls检验表明，三组间两两均有显著性差异(A组与B组Q=16.75,B组与C组Q=8.42,A组与C组Q=8.33, P均＜0.01)。表明Gd-DTPA、Gd-DTPA-McAb对肿瘤组织均有明显的强化作用，Gd-DTPA的强化程度比Gd-DTPA-McAb 的强化程度更为显著。

　　2. 肌肉组织增强前(A组)、Gd-DTPA增强后(B组)及Gd-DTPA-McAb增强后(C组)的T₁WI的信号强度见表3。

　　方差分析结果：F=43.5，P＜0.01，Student-Newman-Keuls检验表明Gd-DTPA对肌肉组织有强化作用(A组与B组Q=12.14,B组与C组Q=10.48,A组与C组Q=1.67,P＜0.01)；而Gd-DTPA-McAb对肌肉组织的信号变化影响不显著(P＞0.05)。

表1　CL-3单克隆抗体偶联DTPA前后的ELISA实验结果

　　C/P=1，pH=0.8，配对t检验，t=4.09,0.002＜P＜0.005

表2　9只鼠肿瘤组织增强前后T₁WI的信号强度（亮度值×10⁵）

　　 表3　9只鼠肌肉组织增强前后T₁WI的信号强度（亮度值×10⁵）

　　表2及表3说明：(1) Gd-DTPA对肿瘤组织及肌肉组织均有强化作用；(2) Gd-DTPA-McAb仅对肿瘤组织有强化作用；(3) Gd-DTPA对肿瘤组织增强的绝对值要高于Gd-DTPA-McAb。

　　荷瘤裸鼠的MRI T₁WI表现见图1～6。

　　图1　横断位T₁WI，平扫示肿瘤组织呈等信号　图2　横断位T₁WI,Gd-DTPA增强扫描示肿瘤组织呈明显高信号　图3　注射Gd-DTPA-McAb后20小时增强扫描，横断位T₁WI示肿瘤组织呈明显高信号　图4　最大斜切位T₁WI，平扫示肿瘤组织为等信号或高信号　图5　最大斜切位T₁WI，Gd-DTPA增强扫描示肿瘤组织呈明显高信号　图6　注射Gd-DTPA-McAb 20 小时增强扫描，最大斜切位T₁WI示肿瘤组织呈明显高信号

讨论

　　磁共振靶向诊断的目的在于通过MRI造影剂标记抗肿瘤McAb 在肿瘤灶内的浓集，以MRI 扫描发现和确定其他影像学手段难以定性的瘤灶及淋巴结转移，以期早期、无创、定性诊断肿瘤。此项研究已取得了一些成就，但尚有许多问题需要解决。

　　一、Gd-DTPA及Gd-DTPA-McAb的增强作用及信号变化分析

　　本实验对裸鼠接种肿瘤的部位进行了MRI平扫、Gd-DTPA增强扫描及Gd-DTPA-McAb增强扫描。其信号变化的规律是：平扫时T₁WI上肿瘤呈等信号或略高信号；Gd-DTPA增强扫描时T₁WI上肿瘤为明显高信号，其亮度值增加3.5×10⁵；Gd-DTPA增强扫描时T₁WI上肿瘤亦呈高信号，其亮度值增加1.7×10⁵，两者对肿瘤组织均有显著的强化作用。Gd-DTPA对肌肉组织亦有增强作用，而Gd-DTPA-McAb对肌肉组织则无增强作用。Gd-DTPA-McAb对肿瘤组织强化的绝对值较Gd-DTPA要小,强化趋势与国外文献报道基本一致^［4］。

　　注射含小剂量Gd的Gd-DTPA-McAb后20小时肿瘤组织呈现强化，其主要原因是McAb与肿瘤表面抗原的特异性结合，正是这种结合，Gd才能特异性地浓集于肿瘤组织内，从而能够在注射Gd-DTPA-McAb 20小时后显示强化。对Gd-DTPA-McAb的强化绝对值小于Gd-DTPA的解释是：两者所用的剂量不同，前者的Gd含量仅为后者的1/10。

　　如何进一步提高肿瘤组织的信号强度，有作者提出以下方法：(1)选择性动脉插管注射造影剂标记的McAb，可提高肿瘤病灶内的造影剂浓度，亦可避免因抗体经过数次循环而到达肿瘤部位途中的损失，损失的主要原因是肝脏的分解代谢和血液中肿瘤抗原的中和；(2)选择分子量较小的单克隆抗体的免疫活性片段［F(ab′)₂、Fab′］代替全抗体，具有较小的分子量，其穿透血管壁的能力较全抗体大，从而有利于提高肿瘤病灶内的造影剂的浓度，提高增强效果^［5］。

　　二、影响DTPA与抗体偶联的因素

　　反应体系的pH值、C/P及抗体浓度等因素均可影响DTPA 与抗体的偶联率，其中反应体系的pH值是影响偶联率的重要因素。不同pH条件下的DTPA与抗体的偶联率不同。本实验提示pH为8.0时DTPA与抗体的偶联率最高。C/P比值亦能影响偶联率，随着c.DTPA比例的增加，偶联率呈降低趋势，但每个抗体分子上所结合的DTPA数是增加的。随着每个抗体分子上所结合的DTPA数目的增加，抗体的免疫学活性有下降趋势。本实验中列出了最佳条件下CL-3抗体的免疫学活性变化，但未就其数量关系作更进一步的探讨。偶联率随抗体浓度的提高而有所提高，但过高浓度的抗体加入Gd时易发生沉淀，故抗体浓度不宜过高。

　　三、磁共振成像扫描

　　本实验只做了T₁WI。基于以下原因：(1)本实验所用的造影剂是 Gd的鳌合物，Gd在低浓度时主要是缩短组织的T₁弛豫时间，而对组织T₂影响较小，本研究比较的是增强前后T₁WI上肿瘤组织的信号强度。(2)目前，临床上在做MRI增强扫描时也只做T₁WI。

　　四、Gd-DTPA-McAb所面临的问题

　　1.稳定性：Gd-DTPA-McAb的稳定性比Gd-DTPA低100倍。Gd是重金属离子，随着Gd的解离，Gd-DTPA-McAb的药物毒性将改变，而且靶部位产生信号的Gd浓度亦降低^［6］。

　　2.Gd-DTPA-McAb的免疫原性：目前使用较多的是鼠原性抗体，若用于人体则属异种蛋白，具有免疫原性，会使人体产生人抗鼠抗体的抗体，即HAMA(human-anti-mouse-antibody)。 可望克服这一问题的方法是：利用基因工程技术生产出人基因重组抗体。

　　五、Gd-DTPA-McAb的应用范围

　　由于单克隆抗体可特异性地识别肿瘤抗原并能与之发生特异性结合反应，故Gd-DTPA-McAbb可特异性地识别肿瘤。可以鉴别肿瘤术后是否有残留和(或)复发及有无转移,特别是对于直径在1cm 左右的小淋巴结是否为转移更有鉴别意义，因为普通的影像学是不能作出确定的回答的，这也是MRI靶向诊断的主要优势之一。

参考文献

　　1　Curtet C,Bourgoin C,Bohy J, et al. Gd-25 DTPA-MAb, a potential NMR contrast agent for MRI in the xenografted nude mouse: preliminary studies.Int J Cancer, 1988,2(Suppl):126-132.

　　2　Saccavini JC, Curtet C,Bohy J, et al. Magnetic resonance imaging studies on nude mice grafted with colorectal adenocarcinoma using gadolinium-labeled monoclonal antibody. Invest Radiol,1988,23(Suppl):S292-293.

　　3　Matsumura A,Shibata Y, Nakagawa K, et al. MRI contrast enhancement by Gd-DTPA-monoclonal antibody in 9L glioma rats. Acta Neurochir,1994,60(Suppl):356 -358.

　　4　Cerdan S,Ltscher HR, Knnecke B, et al . Monoclonal antibody-coated magnetite particles as contrast agents in magnetic resonance imaging of tumors. Mag Reson Med,1989,12: 151-163.

　　5　Ingvar C,Norrgren K, Strand SE, et al. Tumour uptake of monoclonal antibody after regional intraarterial injection:biokinetics in the nude rat heterotransplanted with malignant melanoma. Acta Oncol,1991,30:65-69.

　　6　Duncan JR, Franano FN, Edwards WB, et al. Evidence of gadolinium dissociation from protein-DTPA-gadolinium complexes. Invest Radiol,1994,29(Suppl 2):S58-61.

(收稿:1997-08-28　　修回:1998-02-05)