大肠癌患者检测P¹⁶和Cyclin　D₁的临床意义

山东医药 2000年第13期第40卷 论著

作者：冯凯　吕晓霞

单位：山东省立医院　山东济南250021

关键词：大肠癌　P¹⁶　Cyclin　D₁　原位杂交

　　摘要　采用原位杂交技术检测正常大肠粘膜、息肉及癌组织中P¹⁶、细胞周期素D₁、（Cyclin　D₁）的表达情况，并结合临床资料进行分析。结果显示，P¹⁶在正常大肠粘膜中的阳性表达率最高，息肉组织次之，癌组织最低；癌组织与正常大肠粘膜和息肉组织比较差异显著（P＜0.005）。对大肠癌患者术后随访2年发现，其死亡与存活者的P¹⁶和Cyclin　D₁亦有明显差异（P＜0.01）。正常大肠粘膜和炎性息肉组织未发现Cyclin　D₁过度表达，腺瘤样息肉表达率为7.7％，癌组织表达率大于65％，与正常大肠粘膜和息肉组织比较差异显著（P＜0.005）。相关性分析显示，P¹⁶、Cyclin　D₁在大肠粘膜组织中多数呈反向表达。提示P¹⁶、Cyclin　D₁在大肠癌发生过程中起重要的作用，其反向表达趋势说明可能存在相互抑制机制。

　　Abstract The P¹⁶ and cyclin D₁ expressions was determined in the normal colorectal mucosa，polypous tissue and colorectal carcinoma by using hybridization in situ.the results showed that the positive staining of P¹⁶ was the highest in normal colorectal tissue，polypus was the second and colorectal cancer was the lowest.There was a significant difference between normal colorectal tissue and cancer group（P＜0.05），and showed same result in survival group and death group by follow-up survey 2 years（P＜0.01）.The positive for Cyclin D₁ was not showed in normal colorectal tissue and inflammatory polypous tissue.The positive staining rate was higher 65％ in colorectal cancer（P＜0.005）.An interesting observation was that inverse expression between P¹⁶ and Cyclin D₁ was showed in most of the colorectal cancer.P¹⁶ and Cyclin D₁ was closely related to the occurrence and development of colorectal cancer.The inverse expression between P¹⁶ and CYclin D₁ was closely related to the occurrence and development of colorectal cancer.The inverse expression between P¹⁶ and Cyclin D₁ suggests antagonism between the two，and it plays an important role in the estimation of prognosis.

　　Key Words Colorectal cancer P¹⁶ Cyclin D₁ hybridization in situ

　　人体实体肿瘤的发生和发展是一个十分复杂的过程。现已确定肿瘤由基因病变引起，其中癌基因活化（基因扩增和过度表达等）、抑癌基因失活（突变等）及其他细胞周期调节因子调控失常与肿瘤的发生、发展有密切关系。为了探讨多肿瘤抑制基因P¹⁶和Cyclin　D₁在大肠粘膜上皮细胞的表达情况，我们采用原位杂交技术对84例大肠癌、94例结肠息肉患者的病变进行了P¹⁶、Cyclin　D₁测定，现报告如下。

　　1　资料与方法

　　本文大肠癌患者84例（结肠癌46例、直肠癌38例），结肠息肉94例，无大肠疾病者86例。将手术切除的癌组织、结肠镜下取出的息肉组织及正常大肠粘膜组织迅速用中性福尔马林固定，常规组织脱水后，用石蜡包埋并连续切片，分别进行HE染色，作组织病理学检查和DNA原位杂交实验。根据细胞形态和组织结构变化，本文大肠上皮正常86例；高、中分化腺癌31例，低分化腺癌25例，粘液腺癌16例，未分化癌12例；炎性息肉42例，腺瘤样息肉52例。

　　DNA原位杂交实验试剂分别由美国Cold　Spring　Harbor实验室和Scripps实验室惠赠，实验过程按说明严格操作。各组织样本除用反义RNA探针进行杂交外，同时用不加探针作为对照；最后镜下观察比较显色结果。统计学处理方法采用两样本率比较的X²检验，P＜0.05为显著性差异。

　　2　结果

　　2.1　不同大肠粘膜中的P¹⁶和Cyclin　D₁表达情况　Cyclin　D₁在正常大肠粘膜上皮和炎性息肉组织中无表达，但其随病变加重而表达率增高，未分化癌的表达率有所降低。癌肿的Cyclin　D₁表达率与正常粘膜上皮和息肉比较有显著差异（P＜0.005）。直肠癌与结肠癌及癌肿各组织类型之间的表达率无统计学意义。P¹⁶在正常大肠粘膜上皮表达率最高，随病变发展其表达率逐渐下降；P¹⁶在癌肿组织中的平均表达率为23％。癌肿的P¹⁶表达率与正常大肠粘膜和炎性息肉比较有显著差异（P＜0.005），P¹⁶的表达率与Cyclin　D₁的非表达率有显著负相关性（P＜0.01），详见表1。

表1　不同大肠粘膜组织中P¹⁶和Cyclin　D₁的表达情况

　　注：与正常大肠粘膜及炎性息肉比较，^*P＜0.0052.2　大肠癌有无淋巴结转移者的P¹⁶和Cyclin　D₁表达情况　84例大肠癌患者中，38例有腹腔淋巴结转移，其中伴肝肺转移9例，远处淋巴结转移3例。其有无淋巴结转移者P¹⁶和Cyclin　D₁的表达关系见表2。

表2　大肠癌有无淋巴结转移者的P¹⁶和Cyclin　D₁表达情况

　　注：与有淋巴结转移者比较，^*P＜0.012.3　大肠癌预后与P¹⁶和Cyclin　D₁的表达关系　84例大肠癌患者术后随访2年，其中26例复发后死亡。患者预后与P¹⁶和Cyclin　D₁的表达关系见表3。

表3　大肠癌患者预后与P¹⁶和Cyclin　D₁的表达关系

　　注：与复发死亡者比较，^*P＜0.012.4　本文P¹⁶与Cyclin　D₁表达有交叉共存现象22例，其中两者表达均阳性6例（占7.1％），均阴性16例（占19.1％）；两者表达为反向者62例（占73.8％），明显高于有交叉共存现象者（P＜0.05）。

　　3　讨论

　　P¹⁶是美国分子遗传学家于1994年分离的一种新的肿瘤抑制基因^〔1〕，因其对多种肿瘤起抑制作用，故称为多种肿瘤抑制基因1（MTS1）。P¹⁶位于人染色体9P²¹区位，全长8.5kb，其完整编码序列包括2个内因子和3个外显子。研究发现，P¹⁶基因在众多人类肿瘤中存在相当频繁的突变率和复杂多样的突变形式。据统计，75％的癌细胞株中有P¹⁶基因缺失和突变，超过P⁵³基因50％的突变率^〔2、3〕。

　　目前，已在哺乳动物细胞中分离出8类主要的周期素，连同亚类共11种，Cyclin　D₁癌基因是其中之一。Cyclin　D₁位于人染色体11q¹³区位，长度为120kb，由295个氨基酸构成，分子量为34000，是一类在细胞周期中含量呈周期性变化的细胞周期调节蛋白，它在G1期含量最高、活性最大^〔4〕。

　　真核细胞的分裂必须经过两个关键环节，即G1→S期和G2→M期，周期素依赖激酶（CDK_s）是细胞周期调节的中心，目前发现至少有5种CDK与G1→S期的调节有关，CDK₄最为关键。CDK₄本身无活性，当它与相应的细胞周期蛋白Cyclin　D₁结合后被激活，形成CDK₄-Cyclin　D₁复合物磷酸化P_Rb（为视网膜母细胞瘤基因蛋白），同时释放转录因子E₂F，E₂F可促进DNA的复制和细胞分化，使细胞从G₁期进入S期。磷酸化P_Rb活化P¹⁶的转录，当P¹⁶表达增加时，P¹⁶即与CDK₄结合，破坏CDK₄-Cyclin　D₁的酶活性，使P_Rb磷酸化作用减小。如果解除P¹⁶的抑制作用，P_Rb持续磷酸化，则可导致细胞过度增生，使G1期未充分发育的细胞提前进入S期，这可能是肿瘤发生的主要原因之一。

　　本研究表明，P¹⁶和Cyclin　D₁与大肠癌有以下关系：①P¹⁶的表达缺失与Cyclin　D₁的表达均可发生在正常大肠组织、息肉组织和癌组织中，但其在癌组织中的表达率及强度远高于正常大肠组织和息肉组织；特别是在腺瘤样息肉组织中P¹⁶表达缺失有上升趋势，同时伴有Cyclin　D₁的表达。提示该组因子的变化可能发生在癌变的早期阶段，证明P¹⁶表达缺失和Cyclin　D₁的过度表达与大肠癌的发生有密切关系^〔5～7〕。②与大肠癌组织分化程度的关系：P¹⁶在高中分化腺癌和低分化腺癌中的表达率均超过30％，而在粘液腺癌中无阳性表达，未分化癌阳性表达不到10％，两组比较有明显差异。提示P¹⁶在大肠癌组织中的阳性表达率与肿瘤恶性程度呈负相关，其缺失可能与大肠癌分化不良有关。另外，Cyclin　D₁在大肠癌各组织间的阳性表达无差异性。③与大肠癌患者预后的关系：大肠癌有淋巴结转移者P¹⁶大多数表达缺失，而Cyclin　D₁多呈阳性表达。术后2年未死亡者P¹⁶阳性表达率明显高于复发死亡者（P＜0.01），提示P¹⁶可作为估计大肠癌患者预后的参考指标。Cyclin　D₁在有淋巴结转移者中的阳性表达明显高于无淋巴结转移者（P＜0.01），虽然Cyclin　D₁在死亡与生存者中无统计学意义，但其阳性表达百分率有较明显差异，能否作为判断大肠癌患者的预后指标有待进一步考证。

　　4　参考文献

　　1，Kamb A，Gruis NA，Weaver feldhaus J，et al.A cell cyce regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994，264（12）：436～440.

　　2，Marx J.New tumor Suppressor may rival P⁵³.Science，1994，264（15）：344～345.

　　3，吕肖勇，多基因变异与胃粘膜细胞癌变的关系.中华消化杂志，1996，16（1）：9～13.

　　4，Donnellan R，Chetty R.Cyclin D₁ and human neoplasia.J Clin Pathol：Molpart，1998，51：1～7.

　　5，游学科，卢放根.结肠癌组织中P¹⁶和CDK₄的表达与相互关系.湖南医药，1997，14（14）：195～196.

　　6，Maeda K，Chung YS，Kang SM，et al.Overexpression of Cyclin D₁ and P⁵³ associated with disease recurrence in multistage colorectal adenocarcinoma.Int J Cancer，1997，310～315.

　　7，Arber N，Doki Y，Han EK，et al.Antisense to Cyclin D₁ inhibits the growth and tumor-genicity of human colon cancer cells.Cancer Res，1997，57：1569～1574.

（2000-03-26收稿）