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大肠癌 p53 抑癌基因突变与临床病理特点的关系

大肠癌 p53 抑癌基因突变与临床病理特点的关系

肿瘤防治杂志 2000年第6期第17卷 基础研究

作者:马恒 王磊 孙现军 胡德蓉 刘岩松 李永清

单位:马恒 王磊 孙现军 胡德蓉 刘岩松 李永清(济南市250117 山东省肿瘤防治研究院)

关键词:大肠肿瘤;基因,p53;病理学,临床

  【摘要】 目的:探讨 p53 基因突变与大肠癌临床病理特点的关系。方法:应用 PCR-SSCP 技术检测 135 例大肠癌患者 p53 基因第5、6、7、8外显子的突变。结果:153 例大肠癌患者 p53 基因的突变率为54.07%,p53 基因突变与大肠癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移及年龄均有关。结论:p53 基因与大肠癌的发生、发展及转归均有明显的关系。检测 p53 基因突变既可作为大肠癌的诊断方法,也可作为大肠癌预后的判定指标。

  中图分类号:R735.34    文献标识码:A    文章编号:1009-4571(2000)-0600-04

Relationship Between Mutation of Antioncogene p53 and Clinicopathology in Colcorectal Cancer

MA Heng,WANG Lei,SUN Xian-jun,et al.

  (Shand ong Tumor Hospital,Jinan 250117)

  【Abstract】 Objective:To study the reationship between mutation of p53 gene and clinicopathology in colorectal cancer.Methods:The mutations of exon 5,6,7 and 8 of p53 gene in 135 patient with colcorectal cancer were detected by PCR-SSCP.Results:The mutation rate of p53 gene was 54.07%,and the mutation of p53 gene was correlated with histologie grade,clinical stage,metastasis of lymph nodes and patients'age.Conclusions:p53 genemay play an important role in the onset,development and outcome of colorectal cancer,and detection of mutation of p53 might be a diagnotic method as well as a prognostic factor in colorectal cancer.

  【Key Words】 colorectal cancer;p53 gene;clinicopathology

  采用 PCR-SSCP 方法对大肠癌组织 p53 基因第5、6、7、8外显子突变进行检测,以探讨大肠癌 p53 基因突变及其与临床病理的关系。

  1 材料与方法

  1.1 一般资料

  135 例大肠癌石蜡标本取自山东省肿瘤防治研究院1994年1月~1996年12月经手术切除(不包括局部切除)的大肠癌病例;年龄18~78岁,平均57.6岁。所有病例均经病理证实,并有完整的临床资料。标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋。另选择该院25 例正常大肠粘膜的石蜡标本作对照组。

  原发肿瘤的大小、大体类型、浸润深度、淋巴结转移情况依据原始病理报告。肿瘤部位、远处转移情况依据原手术记录。组织学分型依据《中国常见恶性肿瘤诊治规范》第3分册《大肠癌》之标准进行。大肠癌组织学分级采用 Broder 分级法。大肠癌临床病理分期采用改良 Duke's 分期法。

  1.2 引物选择

  引物合成与纯化由北京赛百盛公司完成,OPC 纯化。p53第5、6、7、8外显子引物序列见表1。

表1 p53基因第5、6、7、8外显子引物序列

引物 序  列 产物大小(bp)
exon 5 5′ TAC TCC CCT GCC CTC AAC AAG A 3′ 181
5′ CGC TAT CTG AGC AGC GCT CAT G 3′
exon 6 5′ GAT TGC TCT TAG GTC TGG CCC CT 3′ 130
5′ CAG ACC TCA GGC GGC TCA TAG G 3′
exon 7 5′ CTA GGT TGG CTC TAG CTG TAC CA 3′ 119
5′ TAG CCT GGA GTC TTC CAG TGT G 3′
exon 8 5′ GTA GTG GTA ATC TAC TGG GAC GGA 3′ 141
5′ GTC GCT TAG TGC TCC CTG GGG GC 3′

  1.3 PCR 扩增体系

  PrimerⅠ 1.0 μ mol/L 1.0 μ1,dNTPs 200 μ mol/L 4.0 μ1,10×Buffer 5.0 μ1 TaqE 1.5 U/L 0.3 μ1,Sample DNA 10.0 μ1,ddH2O 补充至 50 μ1。

  1.4 方法

  1.4.1 标本脱蜡 石蜡包埋组织切成5~10 μm 厚的薄片,取2~3片放入已有编号的 eppendorf管中,加入20 μ1二甲苯,浸泡1 h。微微摇动,经3 000 r/min离心5 min,去上清,如此重复5~8遍。

  1.4.2 梯度水化 依次用浓度为100%、90%、75%、50%、25%的乙醇梯度水化,SSC 液冲洗2遍,去上清。

  1.4.3 消化 向各管中加入消化液 1 ml(1 ml SSC 中含1% SDS 和 100 μg 蛋白酶 K),置55℃水浴 3h。

  1.4.4 纯化 等体积饱合酚萃取1次,加入氯仿:异戊醇(24∶1),颠倒混匀5 min,10 000 r/min 离心10 min,吸取上层水相加入另一已有相应编号的 eppendorf 管中,加入等体积的4℃的异丙醇,混匀后置 -20℃ 20 h,4℃条件下 14 000 r/min离心15 min,去上清,沉淀中加入 1 ml 已预冷至 4℃的75%的乙醇,4℃条件下,14 000 r/min离心15 min,去上清,37℃温箱中保温1 h。

  1.4.5 DNA 含量检测 向烘干的离心管中加入50~100 μl的1×STE,混匀,置4℃中1 h,取5 μl 此溶液于一洁净的康氏管中,加入3ml超纯水混匀,分别在波长处调零点,检测各标本 DNA 的 OD260和 OD280值,并计算相应 DNA 含量。

  1.4.6 PCR 扩增 上述扩增体系按常规加样顺序上机,进行94℃变性,55℃退火,72℃延伸,共35个循环。

  1.4.7 PCR 产物的检测 取10 μl PCR 扩增产物与 1.0 μl 上样缓冲液,混匀后加入到1.5% 琼脂糖凝胶加样孔中,电压8~10V/cm,电泳,至溴酚兰离加样孔2 cm 时,在紫外透射观察仪中观察。

  1.4.8 p53-SSCP 分析 取10 μl MTS-PCR 产物置于 0.5 ml 洁净 Eppendorf 管中,加入等体积的 PAGE 上样缓冲液,经98℃ 5 min热变性后,速冷于0℃的冰水中,然后上样于预冷至 4℃的 PAGE 凝胶中,以80 V条件下电泳,当二甲苯青移至胶长的3/4处停止电泳。取下凝胶,浸于10%冰乙酸中,在恒温摇床上固定30 min。倾去固定液,用超纯水冲洗3遍,每次摇动1~2 min,加入1% AgNO3 染色30 min,再用超纯水冲洗1遍,加入显色液,在摇床上显色至条带清晰而背景不太深时停止。与正常对照的单链DNA 带型的泳动距离对比,观察并记录结果。

  2 结果

  135 例大肠癌及25 例正常粘膜经 PCR扩增后,均成功获得 p53 基因第5、6、7、8外显子的全部片段。25 例正常粘膜经电泳后出现2条带,单链迁移率相同,未见异常突变带。135 例大肠癌有73 例 SSCP 显示有突变条带,阳性率为54.07%,与正常粘膜比较差异有显著性,P<0.01 (表2)。

表2 135 例大肠癌 p53 基因突变情况

组别 总例数 p53+ p53- 阳性率(%) P(χ2)
大肠癌正常粘膜 135

  25

73

  0

62

  25

54.07

  0.00

0.001(24.862)

  第5、6、7、8外显子的突变率分别为15.07% (11/73)、20.54%(15/73)、36.99%(27/73)和27.74%(20/73),它们之间差异无显著性, P>0.05。

  2.1 大肠癌中 p53 基因突变与病理分级的关系

  135 例大肠癌病理分级Ⅰ级59 例,p53 基因突变27 例,突变率为45.76%;Ⅱ级41 例,p53 基因突变 21 例,突变率为51.22%;Ⅲ级35 例,p53基因突变25 例,突变率为71.43%。显示随细胞恶性程度的增高,p53 基因突变率增加,经统计学处理差异有显著性, P<0.05(表3)。

表3 135 例大肠癌 p53 基因突变与病理分级的关系

病理分级 n p53+ p53- 阳性率(%) P(χ2)
ⅠⅡ

  Ⅲ

59

  41

  35

27

  21

  25

32

  20

  10

45.76

  51.22

  71.43

0.049(6.000)

  2.2 大肠癌 p53 基因突变与分期的关系

  135 例大肠癌中,Duke's A期18例,p53 基因突变6 例,突变率为33.33%;B 期48 例,p53基因突变19例,突变率39.58%;C期51例,p53基因突变34例,突变率66.67%;D期18例,p53基因突变14例,突变率77.78%。随分期升高,p53基因突变率增加,差异有极显著性,P<0.01(表4)。

表4 大肠癌 p53基因突变与 Duke's 分期的关系

分期 n p53+ p53- 阳性率(%) P(χ2)
AB

  C

  D

18

  48

  51

  18

6

  19

  34

  14

12

  29

  17

  4

33.33

  39.58

  66.67

  77.78 

0.002(14.506)

  2.3 大肠癌 p53 基因突变与淋巴结转移的关系

  135 例大肠癌中,66 例有淋巴结转移,检测到 p53基因突变45例,p53基因突变率为68.18%;无淋巴结转移者69例,检测到p53基因突变28例,p53基因突变率为40.58%。有无淋巴结转移p53基因的突变率差异有显著性, P<0.01(表5)。

表5 135 例大肠癌中 p53 基因突变与淋巴结转移的关系

组别 n p53+ p53- 阳性率(%) P(χ2)
淋巴结转移(+)

  淋巴结转移(-)

66

  69

45

  28

21

  41

68.180

  40.58 

0.001(10.349)

  2.4 大肠癌p53基因突变与年龄的关系

  135例大肠癌中,年龄≥50岁(高年龄组)79例,检测到p53基因突变34 例,突变率为43.04%;<50岁(低年龄组)56例,检测到p53突变39例,突变率69.64%。低年龄组p53突变率明显高于高年龄组,经校正四格表χ2检验有显著意义,P<0.05(表6)。

表6 135例大肠癌p53基因突变与年龄的关系

年龄(岁) n p53+ p53- 阳性率(%) P(χ2)
≥50<50 79

  56

34

  39

45

  17

43.04

  69.64

0.039(6.023)

  3 讨论  p53 基因是一种抑癌基因,定位于17p13.1染色体上,基因全长16~20Kb,由11个外显子、10个内含子及两侧的序列组成。野生型p53基因对细胞增殖起抑制作用,是重要的细胞生长负调节因子。而突变型p53基因则失去了细胞周期的负调控作用。

  p53基因的突变和缺失与类50余种肿瘤的发生、发展密切相关[1]。大肠癌p53基因的突变率为39%~75%[2,4]

  p53基因失活的方式有基因缺失、点突变和产物的表达降低,其中点突变是最常见的基因改变。突变的选择并不是随即分布的,近90%的p53基因突变集中在4个进化上高度保守区,即第5、6、7、8外显子。因此,检测这些外显子的突变将有助于评估p53基因的激活状态。

  本研究中135例大肠癌p53基因的总突变率为54.07%,与文献报道基本一致[4]。其中第5、6、7、8外显子的突变率分别为15.07%、20.54%、36.99%和27.74%,以第7外显子突变频率最高,第5外显子突变频率最低,但它们之间差异无显著性。其突变方式主要为点突变,另有部分呈缺失性突变。本研究结果证实在散发性大肠癌中p53基因突变在癌变的过程中可能起着重要的作用。

  Yamaguchi 等认为,p53基因突变使细胞增殖活性明显提高,p53基因一旦突变将有可能导致细胞的恶性增殖[5]。Bell等研究了100例大肠癌,显示p53突变率越高,细胞分化程度越差,p53基因突变与细胞恶性程度呈正相关[6]。本研究中135例大肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期 p53基因突变率分别为45.76%、51.22%及71.43%,随分级的升高,p53基因突变率明显增加,差异有显著性(P<0.05),对比Ⅲ级和Ⅰ级 p53的突变率,差异则有极显著性。说明p53基因突变与细胞的恶性程度相关,检测p53基因的突变情况可以初步判定细胞的恶性程度。

  p53基因突变后形成的p53蛋白由于构象改变失去了对DNA的亲和能力,使细胞从G1期向S期的抑制作用减弱,细胞增殖能力加强,恶性程度升高。但也有少数学者认为,p53基因的突变与细胞分化程度无关,p53基因的突变只引起细胞的过度增殖,并不直接影响细胞的分化[7]。我们的结论与多数学者的报道一致,p53基因的突变既可引起细胞的过度增殖,也影响细胞的分化程度。

  Starzynske发现,p53蛋白表达和临床分期及大肠癌的早期复发和死亡率相关[8]。Goh 等[9]报道 Duke's C期大肠癌中p53基因点突变率明显高于Duke's A和 B期。Carson[10] 和 Baker[11] 等也认为p53基因的突变常发生于多阶段癌变的后期,即与肿瘤进展有关。与Goh、Carson等报道相反,Scott 和 Campo 等认为 p53基因的表达与临床分期及生存时间等无关[7,12]。本研究 Duke's 分期中各期 p53基因突变率分别为 33.33%、39.58%、66.67%和77.78%,从A→D期p53基因突变率依次增高,差异有极显著性(P<0.01),显示p53基因突变与肿瘤进展有关,在肿瘤发展的过程中可能会产生新的p53基因突变。因此,p53基因不仅与大肠癌发生有关,更与大肠癌的发展及转归和预后直接相关。p53基因的突变贯穿于大肠癌发生发展的整个过程中,且在大肠癌的发展过程中起着更重要的作用,p53基因的突变应归属于大肠癌发生发展的晚期事件,检测p53基因的突变情况对判断大肠癌的预后将有很大帮助。

  Coh 等研究认为,绝大多数结、直肠癌有p53基因突变,且发现p53基因突变促进癌细胞淋巴结转移,在187 例标本中,淋巴结受累伴p53突变的占70%,而淋巴结未受累p53突变仅占43%[9]。Kastrinakis 等[13]也在大肠癌肝转移灶中发现原发灶中没有的p53基因的突变。说明p53基因突变与淋巴结转移关系密切,p53的突变常发生在肿瘤发展或转移的过程中。本研究中,有淋巴结转移者p53基因的突变率为68.18%,而无淋巴结转移者p53基因的突变率为40.58%,两者之间差异有显著性(P<0.01),显示p53基因突变与大肠癌淋巴转移密切相关。

  135 例大肠癌中,高年龄组的p53基因突变率为43.04%,而低年龄组的为69.44%,二者相比差异有显著性(P<0.05)。这可能与低年龄组多病期较晚、淋巴转移较多及细胞分化较差有关。

  参考文献:

  [1] Chang F,Syrianen S,Kurvinen K,et al.The p53 tumor suppressor gene as a common cellular target in human carcinogenesis[J].Am J Gastroenterol,1993,88:174.

  [2] Monica H,David S,Bert V,et al.p53 mutation in human Cancer[J].Science,1991,293:49.

  [3] Bardesy N,Falkoff D,Petruzzi MJ,et al.Anaplastic wilms tumor,a subtype displaying poor prognosis harbours p53 gene mutations[J].Nature gene,1994,7:91.

  [4] Baker SJ,Fearon ER,Nigro JM,et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas[J].Science,1989,244:217.

  [5] Yamaguchi A,Kurosoka Y,Fushida S,et al.Expression of p53 Protein in Colorectal Cancer and its relationship to short-term prognosis[J].Cancer,1992,70:1778.

  [6] Bell SM,Scott N,Cross D,et al.Prognostic Value of p53 overexpression and c-ki-ras gene mutation in colorectal cancer[J].Gastroenterology,1993,104:57.

  [7] Compo E,de la calle-Martin O,Miquel R,et al.Loss of heterozygosity of p53 gene and p53 protein expression in human colbreetal carcinoma[J].Cancer Res,1991,51:4436.

  [8] Strzynska T,Bromelg M,Chosh A,et al. Prognostic Significance of p53 Overexpression in gastric and colorectal Carcinoma[J].Br J Cancer,1992,66:558.

  [9] Goh HS,Chan CS,Khine K,et al.p53 and behaviour of colorectal cancer[J].Lancet,1994,344:233.

  [10] Carson DA,Lois A.Cancer Progression and p53[J].Lancet,1995,346:1009.

  [11] Baker SJ,Presinger AC,Jessup JM,et al.p53 gene mutations occut in combination with 17p allelic deletions as late event in colorectal tumorigenesis[J].Cancer Res,1990,50:7717.

  [12] Scott N,Sagar P,Steuwart J,et al.p53 in colorectal cancer:clinicopathological correlation and prognostic significance[J]. Br J Cancer,1991,63:317.

  [13] Kastrinakis WV,Ramchurren N,Rieger KM,et al.Increased incidence of p53 mutations is associated with hepatic metastasis in colorectal meoplastic progression[J].Oncogene,1995,11:647.

收稿日期:2000-09-28 修回日期:2000-10-20


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