树突状细胞诱导的抗大肠癌免疫预防裸鼠移植瘤发生并抑制其生长

肿瘤 1999年第5期第19卷 论著

作者：李明松　袁爱力　刘思德　张振书

单位：第一军医大学南方医院消化科(广州510515)

关键词：树突细胞；大肠肿瘤；T淋巴细胞，细胞毒性；免疫疗法；小鼠，裸

　　摘要：目的　研究大肠癌患者外周血树突状细胞(DC)体外诱导抗肿瘤免疫反应能否预防裸鼠移植瘤发生及抑制裸鼠移植瘤生长。方法　联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)从大肠癌患者外周血中培养出DC；人大肠癌细胞系LOVO细胞的肿瘤抗原粗提物刺激DC；DC激活同源的T淋巴细胞；DC激活的T淋巴细胞预防性接种于裸鼠皮下，观察随后接种的人大肠癌细胞系LOVO移植瘤发生率；观察DC激活的T淋巴细胞抑制已接种于裸鼠的人大肠癌细胞系LOVO移植瘤生长。结果　DC体外激活的T淋巴细胞明显能预防裸鼠人大肠癌细胞系LOVO移植瘤发生(预防组10%，对照组100%，P＜0.001)；DC体外激活的T淋巴细胞抑制该移植瘤生长〔对照组、治疗组及加强治疗组肿瘤大小分别为873mm²±19mm²、569mm²±17mm²、361mm²±26mm²，P＜0.05及P＜0.01〕。结论　大肠癌患者外周血DC体外诱导的抗肿瘤细胞免疫反应不仅能预防人大肠癌细胞系LOVO裸鼠移植瘤发生，而且能抑制该移植瘤生长。提示经GM-CSF及IL-4共培养并经TAA激活的DC作为一新概念上的抗肿瘤疫苗，有可能在肿瘤预防及治疗中发挥重要作用。

IMMUNE RESPONSE INDUCED BY DENDRITE CELLS PULSED WITH TUMOR EXTRACTS INHIBITS IN VIVO GROWTH OF IMPLANTED TUMOR AND REJECTS CHALLENGE OF TUMOR CELLS IN NUDE MICE

LI Ming-song,YUAN Ai-li，LIU Si-de，ZHANG Zhen-shu.

(Dept. of Gastroenterology,Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou　510515,China)

　　Abstract：Objective　To study the immune response in vivo induced by dendritic cells(DC) pulsed with tumor extract inhibits the growth of implanted tumor and rejects the challenge of tumor cells in nude mice.Methods　Isolated and purified DC from colon carcinoma patient by combination of granulocyte /macrophage colony stimulating factor and interleukin 4; extracted tumor-associated antigen from human colon carcinoma cell line LOVO cells;initiated the T lymphocyte with DC pulsed by the TAA to produce cytotoxic T lymphocyte(CTL);tested the cytotoxic effect of CTL on LOVO cells;implanted the CTL to nudes to inhibit the growth of implanted tumor and to protect the nudes against further challenge of LOVO cells.Results　The CTL induced by DC pulsed with TAA from LOVO cells can protect the nudes against the challenge of LOVO cells (protection group,10%,contrast group,100%,P＜0.001) and inhibit the growth of implanted tumor in nudes(contrast group 873±19 mm²,therapy group 569±17 mm²,re-therapy group 361±26 mm²，P＜0.05 and P＜0.01).Conclusions　The immune response induced by DC not only inhibits the growth of implanted tumor,but also protects against the challenge of LOVO cells in nudes.The results suggest,as a new concept of anti-tumor vaccine,DC pulsed by TAA may play an important role in treating and preventing tumor.

　　Key words：　Dendritic cells;Colon carcinoma;Tumor immunity;Anti-tumor vaccine；mice,nude

　　目前认为，宿主对肿瘤的排斥依赖于高效而特异的细胞免疫，树突状细胞(DC)在诱导这种免疫反应中起关键作用^［1，2］。但肿瘤患者DC免疫功能常低下，不能有效排斥肿瘤。近期实验已经证实，联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)能增强正常人外周血DC表面免疫分子表达，并进一步增强DC的免疫功能^［3］。本实验以大肠癌患者的DC在体外经GM-CSF及IL-4共刺激，并经人大肠癌细胞系LOVO的肿瘤相关抗原(TAA)激活后，诱导同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，检测该CTL在体外对LOVO细胞等的杀伤作用，并进一步研究该CTL能否预防裸鼠LOVO移植瘤发生及抑制其移植瘤的生长。

　　材料与方法

　　一、实验对象及材料

　　经活检确诊的晚期大肠癌患者1例，男，49岁，未接受任何抗肿瘤治疗。4周龄BALB/c裸鼠25只，其中雄性10只，雌性15只(购自我校动物实验中心)，饲养于SPF级动物实验室。人大肠癌细胞系LOVO细胞(本实验室保存)。人肝癌细胞系HepG2细胞、人骨肉瘤细胞系HOS-8603细胞(购自中山医科大学病理研究所)。GM-CSF、IL-4及IL-2(均为DAKO公司产品)。³H-TdR(北京原子能研究所产品)。

　　二、实验方法^［4～6］

　　1.自大肠癌患者外周静脉血分离单个核细胞(PBMC)及T淋巴细胞。主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；聚丙稀Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；与L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯共培养选择性除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为T淋巴细胞。

　　2.常规培养LOVO细胞，收集LOVO细胞并超声粉碎，收集碎片作为TAA。

　　3.TAA刺激新鲜分离DC，制备TAA特异性的DC。TAA(1×10⁶个LOVO细胞碎片)与结肠癌患者PBMC(1×10⁶，含DC)、GM-CSF(50 U/ml)及IL-4(1000 U/ml)于37℃、5% CO₂共培养24小时。

　　4.TAA特异性的DC与GM-CSF及IL-4体外培养。PBMC悬浮于RPMI-1640中备用，浓度1×10⁵/ml；于16孔板中每孔加入PBMC(1×10⁵/ml)、GM-CSF(100 U/ml)及IL-4(1000 U/ml)置37℃、5% CO₂培养箱中培养5天；收集培养细胞。

　　5.TAA特异性的DC激活同源T淋巴细胞，产生CTL。于多孔板中加入大肠癌患者T细胞(10⁵)，与GM-CSF(100 U/ml)、IL-4(1000 U/ml)及IL-2(100 U/ml)于37℃，5% CO₂中共培养；于培养后第3天收集DC激活的T淋巴细胞，即CTL。

　　6.以DC激活的CTL作为效应细胞，³H-TdR标记的LOVO细胞、HOS-8603肿瘤细胞及HepG2细胞作为靶细胞，效靶比为50∶1进行细胞毒实验。β液闪计数仪测定细胞毒实验前后靶细胞每分钟计数(cpm)。效应细胞对靶细胞的杀伤率表达为：〔(细胞毒实验前总靶细胞cpm-细胞毒实验后活靶细胞cpm)/细胞毒实验前总靶细胞cpm〕×100%。

　　7.DC激活的CTL预防LOVO细胞裸鼠移植瘤的发生：以DC激活的CTL(10⁶)接种于25只裸鼠中随机选择的10只裸鼠一侧背部皮下(预防组)，另15只以生理盐水作对照(对照组)；3天后将对数生长期LOVO细胞(10⁶)接种于上述25只裸鼠，另一侧背部皮下；每3天观察一次接种于裸鼠移植瘤发生情况，直到接种后的第20天。

　　8.DC激活的CTL抑制LOVO细胞裸鼠移植瘤的生长：以上述预防实验中对照组的15只裸鼠进行下一步实验：于接种LOVO细胞(10⁶)后第16天随机选择其中10只裸鼠另一侧背部皮下注射CTL作治疗，5只以生理盐水治疗作对照(对照组)。接种后第22天于上述10只以CTL治疗的裸鼠中随机选5只以CTL作第二次同样治疗，为加强治疗组，另5只以生理盐水治疗作为治疗组。每3天观察一次上述各组移植瘤生长情况，包括移植瘤是否生长及其大小，直到接种后的第37天。肿瘤大小记录为：面积(mm²)=长(mm)×宽(mm)。

　　9.统计学方法：所有变量均表达为±s，以t检验分析两变量间差异性。

　　结果

　　一、CTL及其上清液对LOVO细胞的细胞毒作用　大肠癌患者DC激活的CTL体外对LOVO细胞具有高效而特异的细胞毒活力，而对HOS-8603细胞及HepG2细胞则无明显的杀伤作用。大肠癌患者DC及其未经DC激活的T淋巴细胞对LOVO细胞均无杀伤作用(见表1)。

表1　DC激活的CTL对LOVO细胞等的杀伤力

　　二、DC激活的CTL预防移植瘤的发生　预防组接种LOVO细胞后20天内，10只裸鼠中仅1只有移植瘤发生，而对照组于接种后10天内已见移植瘤发生，14天内15只裸鼠均有移植瘤发生(P＜0.001)。

　　三、DC激活的CTL抑制移植瘤生长　接种后的第37天对照组、治疗组及加强治疗组肿瘤大小分别为873 mm²±19 mm²、569 mm²±17 mm²、361 mm²±26 mm²。生长曲线见附图。与对照组相比，治疗组及加强治疗组移植瘤生长均受到不同程度抑制(P＜0.05，P＜0.01)。在两治疗组中，加强治疗组移植瘤生长受到抑制更明显(P＜0.05)。

附图　DC诱导的CTL对裸鼠LOVO移植瘤的抑制作用

　　讨论

　　本实验显示，以经GM-CSF及IL-4联合培养并经源于LOVO细胞的TAA刺激后的大肠癌患者外周血DC在体外诱导自体T淋巴细胞产生CTL，该CTL对LOVO肿瘤细胞有高效而特异的抗肿瘤作用，而DC本身及未经DC激活的T淋巴细胞均无抗肿瘤作用，因此，本实验以DC激活的CTL作为效应细胞来预防及治疗裸鼠LOVO细胞移植瘤发生与生长，并产生良好的抗肿瘤效应。有关DC诱导的CTL抗肿瘤机制目前尚不清楚。作者近期的体外细胞实验表明，DC诱导的CTL除直接杀伤肿瘤细胞外，还通过CTL分泌的多种细胞因子而发挥抗肿瘤作用，同时CTL能诱导裸鼠移植瘤广泛的细胞凋亡，及明显地抑制肿瘤细胞增殖。

　　DC诱导的抗肿瘤免疫反应不同于过继性免疫治疗，而是一主动免疫反应。小鼠实验显示，以同种异体的DC直接在体内诱导的T细胞免疫不仅能抑制移植瘤生长，并能在小鼠体内产生免疫记忆而防止再次接种的移植瘤发生^［6］。作者的实验虽以裸鼠为对象，但所用诱导细胞及效应细胞均来自大肠癌患者，实际上是以裸鼠为媒介来进行人体细胞实验，为下一步进行人体实验作准备。由于诱导细胞及效应细胞均来自大肠癌患者，其在裸鼠体内有一定的生存期，而裸鼠体内并不具备效应细胞继续增殖的环境，因此效应细胞在裸鼠体内发挥抗肿瘤作用的时间仍然有限。分析生长曲线可发现，DC诱导的抗肿瘤作用在一周左右明显减弱。若直接以大肠癌患者为实验对象，则这一问题似可解决。因为患者体内有丰富的静息状态T细胞(naive T cell)，直接向患者体内回输经GM-CSF及IL-4联合培养并经TAA刺激的DC，应能在患者体内诱导出高效而特异的抗肿瘤CTL，在适度的GM-CSF、IL-4及IL-2的协同作用下，将能保持诱导细胞及效应细胞较持久的生物活性，从而发挥较持久的抗肿瘤作用。该过程的实质是以增强了大肠癌患者的DC免疫活力，从而启动了主动的特异的抗肿瘤免疫。

　　过去认为荷瘤宿主免疫系统常受到不同程度抑制，主要表现为T或B淋巴细胞受到抑制，从而导致肿瘤逃避宿主免疫监视。目前则倾向于认为荷瘤宿主免疫系统受抑制主要表现为DC免疫功能低下，若联合应用细胞因子，如GM-CSF、IL-4及TNF等，则能恢复并增强荷瘤宿主DC的免疫功能，从而增强宿主抗肿瘤能力^［2］。

　　本实验从大肠癌患者外周血中获得大量的DC，与患者有良好的组织相容性，又以LOVO细胞粗提物作为TAA，从而有利于体外制备及进一步纯化特异的TAA。再在体外经细胞因子及TAA刺激的DC被回输给患者，以便激活其体内丰富的T细胞，产生CTL，这是DC在体内外能诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫反应，因而其实质是一全新概念上的抗肿瘤疫苗^［1，2］。将为肿瘤临床提供一条安全、简便、高效的治疗途径。

　　作者简介：李明松，男，医学博士，讲师，主治医师。

　　参考文献

　　［1］Pioche C,Salomon B,Klatzmann D.Dendritic cells and tumor cell therapy.Pathol Biol,Paris,1995,43(10):904

　　［2］Chauz P.Dendritic cells and immune function in cancer.Pathol Biol,Paris,1995,43(10):897

　　［3］Sallusto F,Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by culture human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and down-regulated by tumor necrosis factor α.J Exp Med,1994,179:1109

　　［4］Thomas R,Davis LS,Lipsky PE.Comparative accessory cell function of human peripheral blood dendritic cells and monocytes.Immunol,1993,151(12):6840

　　［5］Barratt-Boyes SM,Henderson RA,Finn OJ.Chimpanzee dendritic cells with potent immuno-stimulatory function can be propagated from peripheral blood. Immunology,1996,87:528

　　［6］Nair SK,Synder D,Rouse BT, et al. Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen-presenting cells pulsed with tumor extracts.Int J Cancer,1997,70:706

(收稿日期：1998-06-23　修回日期：1998-08-03)