大肠癌原发灶和肝转移灶p53变异及蛋白表达

中华肿瘤杂志 1999年第2期第0卷 临床研究

作者：杨洋　夏琼　连方杰　秦斌

单位：510515 广州，南方医院肿瘤科实验室

　　关键词： 结直肠肿瘤；肝肿瘤/继发性；p53基因；p53蛋白

　　【摘要】　目的　了解p53基因及其蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化。方法　p53基因外显子5～9以DGGE及自动DNA序列分析来检测，p53蛋白表达以免疫组化方法检测。结果　34例中21例呈p53变异，占61.8%(包括2例PCR失败但免疫染色阳性者)，其中5例仅在肝转移灶发现p53变异，其余均为原发灶、转移灶一致性的变异。另有2例原发灶即有p53变异者，在转移灶出现了新增加的变异。在37处变异中，27处为错义突变，占73.0%；6处为无义突变，占16.2%；4处微小插入。在原发、转移灶同时有单个碱基改变的14例中，13例呈现变异的p53碱基峰和正常峰之比，在肝转移灶明显高于大肠原发灶(P＜0.001)。p53免疫组化染色结果和DGGE、DNA序列分析结果高度一致。但4例(6处)呈无义突变的病例，免疫组化均为阴性。另有3例在DGGE和序列分析中无法证明任何p53变异的大肠癌原发灶，免疫组化显示p53蛋白的过度表达。结论　在大肠癌肝转移过程中，p53变异主要开始于肠癌原发灶，并被保持于转移至肝脏的癌细胞内，在转移灶其含量或含变异p53的癌细胞量明显增加。小部分p53变异也可以始发于转移灶。p53变异与p53蛋白过度表达呈正相关。但单独应用p53基因检测或免疫组化技术均可导致假阴性的出现。

　　p53 mutations and protein overexpression in primary colorectal cancer and its liver metastasis　　YANG Yang, XIA Qiong, LIAN Fangjie, et al. Department of Oncology, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515

　　【Abstract】　Objective　To compare p53 status between primary and hepatic metastatic colorectal cancer in 34 patients.Methods　p53 gene status (exon 5-9) was examined by PCR, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and automated sequencing. p53 protein was detected by immunohistochemistry using monoclonal antibody DO-7.Results　p53 mutations were found in exons 5 through 9 in 21 of 34 patients (61.8%). Among them, 5 patients had mutation in liver metastasis but not in their primary tumor while in the other 4 patients the same mutations were found in both primary and metastatic colorectal cancers. In no patients was p53 mutation exclusively found in the primary colorectal tumor. Moreover, additional mutation was detected in the metastatic lesions in two cases. Of the 37 mutations within the exons examined, 73% was missense mutation and 16% was nonsense mutation. There were 4 microinsertions. p53 protein was overexpressed in both primary and metastatic colorectal cancers with p53 gene mutations. The presence of p53 mutations significantly correlated with p53 protein accumulation (r=0.96, P＜0.001). However, in 4 patients with p53 nonsense mutation, immunohistochemical staining was negative. In three patients who showed no p53 mutation of the primary tumor, p53 protein was consistently over-expressed.Conclusion　In colorectal cancer, p53 gene mutation usually appears first in the primary tumor and maintains as such but more prominent when metastasized to the liver. However, p53 gene mutation may occur only after being metastasized. Although p53 gene mutation and p53 protein overexpression correlate with each other, either parameter examined alone may lead to false positive results.

　　【Subject words】　Colorectal neoplasms　　Liver neoplasms/secondary　　p53 gene　　p53 protein

　　关于p53与大肠癌及其肝转移的研究已有很多^［1，2］，但尚未见在同一患者个体水平上观察比较其原发灶和转移灶p53状态的报道。我们选择了34例大肠癌术后并发肝转移者，应用DGGE(denaturing gradient get electro-phoresis)和自动DNA序列分析技术，对每一个体的原发病灶和肝转移灶的p53状态进行检测并比较，以了解在癌瘤发生、发展、转移过程中p53基因的改变及其意义。

　　材料和方法

　　1.肿瘤组织标本：收集大肠癌根治性切除术后5个月～5年内，因肝转移接受肝切除术患者的大肠原发灶及肝转移灶石蜡标本共34例。全部标本的组织定性均为大肠腺癌，其肿瘤细胞含量＞90%。

　　2.DNA提取：石蜡切片首先脱蜡至水化，然后经蛋白酶K/SDS TE缓冲液在48℃下消化48小时，再经饱和酚/氯仿抽提，最后以3 mol/L的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的95%乙醇沉淀DNA。在紫外分光光度计下测吸光度A 260/A 280(曾称光密度OD)，二者比值通常在1.7～1.8。合格的DNA样品保存于-70℃下。

　　3.PCR：DNA样品首先在94℃处理4分钟，以灭活蛋白酶。PCR扩增条件为95℃ 30秒→58℃ 30秒→72℃ 90秒，共35个循环。最后经过72℃ 7分钟“延伸”步骤，进入4℃程序下保存。PCR产物经2.7%琼脂电泳确认为单一条带者为合格。为便于DGGE分析，在每一对引物的正向引物5′端加有一个28 bp长的GC-rich序列(表1)。

表1　p53引物及DGGE电泳条件

　　^* (GC)=5′-CGCCCGCCGCGGCCCGCCGCCCCGCCCG-3′　　4.DGGE：DGGE按照文献［3，4］所述方法进行。首先利用垂直型DGGE，确定每一外显子的最适变性剂浓度范围。然后通过平行DGGE进行样品检测，电泳时的温度为56℃，电压为150 V，所需时间依外显子的不同而不同(表1)。电泳后，胶板经3 μg/ml的溴化乙啶染色20分钟，在紫外灯透照器上观察并摄像。

　　5.DNA序列分析：在DGGE分析中检出p53变异条带的样本需进一步进行DNA序列分析。大约100 ng纯化后的PCR片断被作为模板加到20 μl DNA序列分析反应液中(Perkin Elmer, USA)，反应液含3.2×10^-12 mol/L和DGGE同样的引物。分别经95℃ 30秒，50℃ 15秒，60℃ 4分钟25个周期处理后，酒精沉淀产物，沉淀物再被溶解于25 μl的template suppression reagent (Perkin Elmer)内，在ABI PRISM^TM310自动基因序列分析仪中分析。每一样本均分别进行正向和反向两个方向的检测。当一个肿瘤标本有一个以上的p53变异时，需再重复一次全部反应过程(包括DNA扩增，PCR片断的提纯以及序列分析)，以排除假阳性。

　　6.p53免疫组化染色：石蜡切片脱蜡至水化，微波炉处理5分钟后，用ABC法染色(p53单克隆抗体为DO-7，1∶500稀释)，DAB显色，苏木素复染，于普通显微镜下观察。阳性核染色的细胞＞5%者，被视为阳性^［1］。

　　7.统计学处理：用t检验检测变异碱基峰/正常峰在原发灶和转移灶的比值。p53变异与p53过度表达相关性的检测以Chisquare检测法处理。P值＞0.05者为差异有显著性。

　　结　果

　　1.p53变异分析：DGGE和序列分析结果见图1。在34例受检患者中，2例PCR失败。剩余32例中，19例(59.4%)在p53外显子5～9发现变异，其中14例显示大肠原发灶和肝转移灶为相同的变异，5例显示p53变异仅发生于肝转移组织；另有2例原发灶即有p53变异的患者，在转移灶除保留原有变异外，还出现了新增加的变异(表2)。在原发、转移灶共37处p53变异中，73.0%(27/37)是错义突变，16.2(6/37)为无义突变，4处插入突变。在所有点变异中，主要为G→A和C→T碱基转换，只有6例为碱基颠换。

　　序列分析曲线显示，在原发、转移灶同时有single base改变的14例中，13例p53变异峰和正常峰之比在肝脏转移灶高于大肠原发灶(图1，P＜0.001)。

　　表2　大肠癌继发肝转移患者原发灶和转移灶p53基因突变及p53蛋白过度表达

　　注：p53野生型者未列入表中

　　2.p53免疫组化染色结果：34例中，17例呈原发灶和转移灶一致性的p53蛋白过度表达。p53免疫组化和DNA序列分析的结果高度一致(r=0.96，

　　P＜0.001)。在所有p53过度表达的肝转移标本，通过DGGE和序列分析，均可以证实到p53的变异，但在3例显示p53过度表达的肠癌原发灶，DGGE和序列分析无法证明有任何形式的p53变异。此外，4例(6处)序列分析显示无义突变者，其免疫组化均为阴性染色。

　　讨　论

　　关于p53基因和大肠癌发生、转移的关系，已有许多研究报道^{［1，5，6］}，但均局限于原发灶和转移灶组与组间的比较。如果比较每一单一个体的大肠癌原发灶和肝转移灶，就有可能证实大肠癌继发肝转移者，p53变异是否主要首发于肠肿瘤原发灶，并确切了解在癌细胞转移过程中，细胞内野生的或已变异的p53是否发生变化及其意义。

　　本实验基因分析证明，14例在原发灶显示的p53变异，在其相应的转移灶均被证实。另有5例在大肠癌原发灶未证实到p53变异的患者，在肝转移灶出现了p53变异，2例在原发灶已有p53变异的患者，在转移灶除观察到同样的变异外，还发现了新的变异。由此证明，p53变异主要开始于原发大肠癌灶，并保持于转移到肝脏的大肠癌细胞内，在转移过程中变异了的p53特性不变，只有极少数其变异的位点增多。在大肠癌未被发现而在肝脏转移灶出现的p53变异以及新增加的变异位点，提示p53改变也可能始发于转移癌灶。我们没有发现一例在原发灶发生的p53变异在癌转移灶内丢失。

　　通过DNA序列分析进一步发现，具有同一single base变异的病例，变异碱基峰与正常峰之比，在肝转移标本明显地高于相应的大肠癌标本。由于在提取DNA之前切片均经镜下确认，不论在大肠还是肝转移标本，瘤细胞含量均占总组织细胞90%以上，因此排除了大肠标本含有较多正常组织细胞的可能。以上结果应更多地被考虑为在转移灶变异p53基因含量或含有变异p53的癌细胞含量增加。后者将通过失去野生型p53在细胞周期中的负性调节作用促进癌细胞恶性增殖，这也许从分子基因角度解释了为什么转移后的肿瘤生长更快。本组标本3个p53变异热点分别在外显子8的248及273密码子，和外显子6的196密码子，与文献报道^［1，2］相符。点变异主要表现为G∶C→A∶T的改变。

　　由表2可见，本研究有3例患者，在大肠癌灶可以观察到免疫组化显示的p53蛋白过度表达，却无法在DGGE和DNA序列分析中得到证实，但它们的转移灶均呈现p53变异和p53蛋白过度表达。其原因可能是变异的p53水平在大肠原发灶尚低。Beck等^［7］曾报道，在DGGE检测中，如变异的基因含量少于10%，其变异条带就很难被肉眼观察到，含量极低的变异p53在DNA测序中也极易被正常碱基峰遮盖。这一结果还提示，尽管DGGE和DNA序列分析是十分先进的技术，但不能以此取代免疫组化方法。这不仅因为后者能够反映p53在蛋白水平的改变，还因为在某些时候，特别是变异的p53明显少于野生型时，免疫组化染色比DNA分析技术更加敏感。

　　此外，本研究中4例显示无义突变的基因改变，在免疫组化染色均为阴性。这是由于免疫组化检测到的表达增加是突变型p53表达增加，是由错义突变所致，而无义突变可使野生型p53失活，但不形成突变型p53，故不会导致表达增加，这说明单独使用免疫组化技术也可引起假阴性。免疫组化技术必须和基因检测技术结合使用。

　　志谢　瑞典哥德堡大学医学部外科Peter Naredi, Kent lundholm和Ann Forslund

　　本课题受Clinic Cancer Research Foundation in Sweden资助

　　参考文献

　　1　Pocard M. Different p53 mutations produce distinct effects on the ability of colon carcinoma cells to become blocked at the G₁/S boundary after irradiation. Oncogene, 1996,12：875-882.

　　2　Diez M, Camunas J, Enriquez JM, et al. A Comparative study on the prognostic value of the nuclear expression of protein p53 vis-a-vis histopathology in colorectal cancer. An Med Interna, 1996,13：222-226.

　　3　Cottu PH, Muzeau F. Inverse correlation between RER⁺ status and p53 mutation in colorectal cancer cell lines. Oncogene, 1996,13：2727-30.

　　4　Kropveld A, Slootweg PJ, Mansfeld AD, et al. Radioresistance and p53 status of T₂ laryngeal carcinoma: analysis by immunohistochemistry and DGGE. Cancer, 1996,78：991-7.

　　5　Masahiro W. Allelic loss of chromosome 17P, mutation of the p53 gene, and microsatellite instability in right-and left-sided colorectal cancer. Cancer, 1996, 77 Suppl：1688-1693.

　　6　Masataka kato. Detection of DCC and Ki-ras gene alterations in colorectal carcinoma tissue as prognostic markers for liver metastatic recurrence. Cancer, 1996, 77 Suppl：1729-1735.

　　7　Beck JS, Kwitek AE. A denaturing gradient gel electrophoresis assay for sensitive detection of p53 mutations. Human Genetics, 1993,91：25-3.

(收稿：1998-07-22　　修回：1998-09-28)