聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法检测大肠腺瘤及大肠癌APC基因突变

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：王艳　刘士良　郝冬梅　庄宝珠　张学　傅宝玉

单位：110021 中国医科大学第三临床学院消化内科(王艳)；中国医科大学第一临床学院消化内科(刘士良、庄宝珠、傅宝玉)；中国医科大学分子遗传室(张学)；解放军第二○二医院计划生育研究室(郝冬梅)

　　关键词： 结直肠肿瘤；腺瘤；APC基因；突变；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　对15例散发性大肠腺瘤组织和45例大肠癌组织及其各自的正常肠粘膜组织，进行家族性腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)第15外显子MCR区域的基因突变检测。方法　应用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术进行检测。结果　在散发性大肠腺瘤组织中检出突变率为20.0%(3/15)，在大肠癌组织中的突变率为22.2%(10/45)。实验结果表明，APC基因在散发性大肠腺瘤与大肠癌中均有较高突变频率，两者差异无显著性；APC基因突变在大肠癌中与肿瘤的大小、位置、组织分化程度和有无淋巴结转移无关；APC基因第15外显子的MCR区域是该基因突变的集中区域，且以1339～1436密码子区域突变率最高，1260～1359密码子区域突变率最低。结论　证实了APC基因突变发生于腺瘤形成阶段，属于大肠癌发生的早期事件。

　　Mutations of APC gene MCR region in sporadic colorectal adenomas and carcinomas　　Wang yan, Liu Shiliang, Hao Dongmei, et al. Department of Gastroenterology, The Third Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110021

　　【Abstract】　Objective　Fifteen specimens of colorectal adenomas and 45 specimens of carcinomas and each of their normal mucosa were analyzed for the APC gene exon 15 MCR(mutation cluster region).Methods　Gene mutation was examined by PCR-SSCP technique.Results　In three out of 15 cases of adenomas(20.0%) and 10 out of 45 cases of carcinomas(22.2%), mutations at MCR was detected. In colorectal carcinoma, APC gene mutation was not related to size, location, histologic features and lymph node metastases. In MCR region, 1260～1359 codons gave a lowest mutation frequency, while 1339～1436 codons showed the highest mutation frequency.Conclusion　APC gene mutation detected in colorecral adenomas indicates that the APC gene mutation is an early event in colorectal carcinogenesis. It helps early diagnosis of colorectal carcinoma.

　　【Subject words】　Colorectal neoplasms　　Adenoma　　APC gene　　Mutation　　Polymerase chain reaction

　　现代分子生物学的大量研究揭示，大肠癌在发展过程中涉及到癌基因(K-ras等)的激活和抑癌基因(APC， p53，MCC，DCC等)的失活^［1，2］。对家族性腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)的研究发现，该基因在大多数大肠肿瘤中有突变或缺失，与大肠癌的发生密切相关。“腺瘤→腺瘤”模式普遍被认为是70%大肠癌的发展规律，因此，研究腺瘤中APC基因突变对研究大肠癌的发生发展过程具有实际意义。我们用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术检测MCR区段的突变，试图探索中国人大肠腺瘤及大肠癌APC基因突变的特点及其与临床关系、病理学特点的相关性，为大肠癌的早期诊断和治疗提供一个分子生物学指标。

材料与方法

　　1.标本：15例大肠腺瘤组织及正常肠粘膜组织取自中国医科大学第一临床学院消化内窥镜室的电切标本，均经病理证实为腺瘤性息肉(其他炎性息肉均已舍弃)。45例大肠癌组织及癌旁5 cm以外正常粘膜组织取自中国医科大学第一临床学院外科手术切除标本，均经病理证实为大肠癌，同时取正常人的正常肠粘膜组织作为对照。切下的新鲜标本立即用生理盐水冲洗后切成小块置-70℃冰箱中保存。

　　2.DNA提取：取冰冻组织约0.2 g捣碎，加TE缓冲液(10 mmol/L Tri-cl-EDTA, pH8.0)研至匀浆状后加入适量1%SDS，100 μg/μl蛋白酶K，37℃消化过夜，常规酚、氯仿法抽提3次，加入适量3 mol/L乙酸钠和冷乙醇沉淀出DNA纤维丝，室温干燥后加入适量TE，用紫外分光光度计测算DNA的浓度和纯度后置4℃中保存。

　　3.PCR引物及扩增条件：第15外显子1260～1593密码子区用4对引物扩增，引物顺序见表1。

表1　所用APC引物顺序

　　PCR反应体系为10 μl，取模板DNA100 ng，加入1U Taq酶，0.5μl dNTP(终浓度0.1 mmol/L)，引物各4pmol，10×缓冲液1μl(含Mg²⁺离子1.5 mmol/L)，α-³²P-dCTP 37kBq混匀，95℃变性2分钟，94℃变性45秒，50℃复性45秒，72℃延伸45秒，循环30周，扩增产物加入20μl甲酰胺变性示踪剂，-20℃保存。

　　4.SSCP电泳：PCR扩增产物经95℃变性10分钟后于冰浴中骤冷，取3μl上样于6%中性聚丙烯酰胺凝胶，甘油浓度5%，0.5×TBE为缓冲液，30W 19℃电泳4～5小时，电泳完毕在暗盒中覆盖X线胶片，-70℃放射自显影24～48小时后显影，定影。每一肿瘤组织(癌T，腺瘤P)均有其自身正常粘膜组织DNA(N)作对照，并在每次电泳时加入正常人的肠粘膜组织DNA(N′)作对照。所用的A、B、C、D 4对引物在正常组织中的扩增产物均为密度一致的两条带，如肿瘤组织出现与正常对照组织不同的单链泳动变位或额外带即为突变。所得资料均经四格表精确概率法处理，差异有显著性P＜0.05。

结果

　　所用APC基因的4对引物在正常组织中的扩增产物为密度一致的两条带，60例正常对照组织DNA无一例检出APC基因MCR区域突变，说明无生殖细胞突变。在15例散发性腺瘤中检出3例突变，1例为突变纯合子，表现为泳动变位；2例为突变杂合子，表现为额外带，突变率为20.0%(3/15)，分别位于B区、A区、D区。2例突变为绒毛状腺瘤，1例为绒毛管状腺瘤。在45例大肠癌组织中检出10例突变，突变率为22.2%(10/45)，B区检出6例，C区2例，D区2例。分别按肿瘤的大小、位置、分化程度及有无淋巴结转移进行统计，用χ²检验比较其差异的显著性，结果见表2。

表2　45例大肠癌中APC基因突变与大小、位置、分化程度及淋巴结转移的比较

　　我们对45例中国人大肠癌中的10例突变在A、B、C、D区的突变率分布情况，与Miyaki等^［3］用同样方法对141例日本人大肠癌中检出的47例突变分布情况进行了比较，结果见表3。

讨论

　　大肠癌的发生发展是一个涉及到多个癌相关基因改变的复杂过程，这些基因的改变遵循一定的顺序，即在由“正常细胞→腺瘤→腺癌→癌转移”的演变过程中依次发生“APC→K-ras→P53→DCC”的突变，因此，研究腺瘤中APC基因的突变对大肠癌的

表3　大肠癌中MCR区域A、B、C、D区检出突变率(%)

　　注：(　)内为例数

早期诊断有十分重要的意义。APC基因的发现源于对FAP(家族性腺瘤性息肉病)的研究^［4］，被克隆定位于5q21，含15个外显子，cDNA有8 972个核苷酸，是2 843或2 742个氨基酸的多肽，分子量312 000，其第15外显子很大，占整个编码区的77%。APC蛋白的氨基端有高度蜷曲的螺旋结构，具有高度亲水性，定位于细胞质，其抑癌机理尚不清楚^［5］。在散发性大肠癌中APC基因的LOH为40%，体细胞突变率为60%^［6］。APC基因的点突变好发于CpG,CpA区，碱基缺失以5bp的缺失最为常见，好发于碱基重复区域，90%的突变导致截断APC蛋白的产生。

　　从本研究的结果可以看出，腺瘤中检出突变率为20.0%，在癌中为22.2%，差异无显著性，且在大肠癌中与肿瘤的大小、位置、淋巴结转移、组织分化程度无关。可见，APC基因突变在腺瘤阶段就已发生并在此后一直保存下去，进一步证实了APC基因突变发生于腺瘤形成阶段。而p53、K-ras、MCC、DCC等基因在腺瘤中的检出率很低，在腺癌或转移癌中突变检出率明显增高^［7］，说明这些基因在将发生癌变时或肿瘤转移时发生突变，检出时肿瘤往往已经恶变或转移。

　　直经＞2.0 cm，重度不典型增生的腺瘤的癌变率增加，绒毛状腺瘤和绒毛管状腺瘤的癌变率高于管状腺瘤。Benedetti等^［8］报道绒毛状及绒毛管状腺瘤(多是位于直肠的大腺瘤)APC基因的突变率高于管状腺瘤，但在大肠癌的不同组织学类型中APC基因突变无明显差异。我们对45例大肠癌中所检出的10例突变进行分析，发现与肿瘤的大小、位置、分化程度及淋巴结转移无关(P值均＞0.05)，与国外同类研究的报道相符。

　　Miyaki等发现60%大肠肿瘤的APC基因突变发生于APC基因第15外显子的5′端1 286～1 513 codon之间，将此区域称为突变集中区域(mutation cluster region, MCR)。Miyaki对MCR区域A、B、C、D区分别计算了突变率，并总结出MCR区域内的5个突变热点：密码子1 309、1 378、1 450、1 464和1 487-1 490。我们与Miyaki的结果进行了比较：A区在日本人的突变率较高(29.8%)，但本实验在大肠癌中未能检出A区的突变，说明1 309密码子可能不是中国人的突变热点；B区在日本人和中国人同是突变最多的区域，中国人(60.0%)略高于日本人(46.8%)，说明1 378密码子在中国人也是突变热点；D区日本人的突变率较低(2.1%)，而本实验结果为20.0%，说明D区在中国人可能存在一个新的突变热点。我们与Miyaki比较的结果表明，差异可能是由于样本误差造成的，或是地理、环境、饮食等因素不同所致，但仍提示中国人和日本人之间可能存在种族差异。

　　已有实验发现，将含5q的染色体导入体外培养的结肠癌细胞株中，成功地抑制了癌细胞的生长，即集落形成及在裸鼠体内的致癌作用^［9］，为大肠癌的基因治疗开辟了新方向。进一步研究APC基因的结构及功能的关系及其与其他基因的相互作用，不仅有利于我们从分子水平认识大肠癌的发病机理，同时为大肠癌的早期诊断和基因治疗提供了新的途径。

　　本课题受省自然科学基金资助

参考文献

　　1Vogelstein B, Fearon ER. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990, 61: 759-769.

　　2Bishop JM. Molecular themes in oncogenesis. Cell, 1991, 64: 235-248.

　　3Miyaki M, Konishi M, ReiKY, et al. Characteristic of somatic mutation of the APC gene in colorectal tumors. Cancer Res, 1992, 54: 3011-3020.

　　4Kinzler KW, Nilbert MC, Su LK, et al. Identification of FAP locus genes from 5q21. Science, 1991, 253:661-664.

　　5Munemitsu S, Souza B, Mller O, et al. The APC gene product associates with microtubules in vivo and promotes their assembly in vitro. Cancer Res, 1994, 54: 3676-3681.

　　6Powell SM, Zilz N, Yasmin BB, et al. APC mutation occurs early during colorectal tumorigenesis. Nature, 1992, 359:235-237.

　　7Boland CR, Sato J, Appelman HD, et al. Microalle typing defines the sequence and tempo of allelic losses of tumour supressor gene loci during colorectal cancer progression. Nature Medicine, 1995, 1:902-909.

　　8Benedetti LD, Sciallero S, Gismondi V, et al. Association of APC gene mutations and histological characteristic of colorectal adnomas. Cancer Res, 1994, 54: 3553-3556.

　　9Grodem J, Joslyn G, Samorritz W, et al. Response of colon cancer lines to the introduction of APC, a colon cancer-specific tumor suppresion gene. Cancer Res, 1995, 55: 1531-1539.

(收稿：1997-12-12　　修回：1998-02-16)