大肠癌淋巴结微转移的预后意义

　　中华普通外科杂志2000年第15卷第3期

　　骆成玉　李世拥　赵丹宁　邓永江　曲军　祝学光

　　 摘　要　目的：研究大肠癌淋巴结微转移情况及临床意义。方法：以靶向细胞角蛋白20（cytokeratin20,CK20） mRNA的逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法，检测17例大肠癌的150枚淋巴结。结果：17例大肠癌经常规组织学和CK20 rT-PCR检出有淋巴结转移分别为6例（35.3%,6/17）和9例(52.9%,9/17)；150枚淋巴结用常规组织学和CK20 rT-PCR分别检出癌转移是 19枚(12.7%,19/150) 和45枚(30%,45/150)（P＜0.01)。常规组织学检查阴性的131枚淋巴结，CK20 rT-PCR检出微转移 26枚(19.8%,26/131)。随访中发现，淋巴结微转移多者预后差。结论：CK20 rT-PCR法较常规组织学检查具有更高的敏感性，提高了淋巴结微转移的检出率和临床分期的准确性。研究大肠癌淋巴结微转移，对判断患者预后、指导术后辅助治疗具有重要意义。

　　 关键词：结肠肿瘤　淋巴结　转移　角蛋白

　　大肠癌淋巴结转移的有无及转移淋巴结数目的多少均与患者预后密切相关。无淋巴结转移患者多数可获治愈，5年生存率可达70%以上；有淋巴结转移者5年生存率大大降低，不足30%。淋巴结转移数目愈多预后愈差，1～5个转移者5年生存率为24%，而6～10个者则降为9%。辅助性化学药物治疗(化疗)作为有淋巴结转移者的标准治疗，可以明显增加其生存率，但通常对无淋巴结转移者不予辅助治疗，其5年复发转移率达30%～40%^［1-3］。常规组织学检测淋巴结微小转移常有遗漏，直接影响着临床分期的准确性、预后预测以及辅助治疗的选择。因此，对淋巴结微转移的检测，将使部分组织学无淋巴结转移患者中具有高危复发和转移倾向者得益于辅助化疗。我们使用细胞角蛋白20（cytokeratin20,CK20）的逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法，检测大肠癌淋巴结微转移情况，并探讨其与预后的关系。

　　资料与方法

　　1.标本：150枚淋巴结取自17例（8.8枚/例）行根治术的大肠癌患者。每个新鲜淋巴结标本均分两半，一半行常规病理组织染色，另一半立即置液氮速冻，-80℃保存，待作CK20 mRNA 的RT-PCR。

　　2.引物:按文献报道^［4］ CK20基因序列，由军事医学科学院生物工程研究所合成。CK20正义链：5′-CAGACACACGGTGAACTATGG-3′，反义链：5′-GATCA-GCTTCCACTGTTAGACG-3′；β₂-微球蛋白（β₂-microglo-bin，β₂-MG）正义链：5′-ACCCCCAC-TGAAAAAGATGA-3′;反义链：5′-ATCTTCAAACCTCCATAGTG-3′。

　　3.总RNA提取、cDNA合成及RT-PCR：根据我们已报道的方法^［5］，设计β₂-MG作为内参对照，以证实所提取RNA足量、完整、可比，β₂-MG扩增产物（120　bp）与CK20扩增产物（370　bp）的电泳条带之间距离合适便于观察分析。反应产物行2％琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色，紫外光下照相记录。每条泳道代表1个淋巴结标本的扩增结果，每个标本可扩出两条电泳条带，一条为内参对照β₂-MG，另一条为目的基因CK20。

　　4．统计学处理：采用卡方检验。

　　结果

　　1.大肠癌淋巴结转移检出情况：本组17例大肠癌经常规病理组织学和CK20 rT-PCR检出有淋巴结转移分别为6例（35.3%,6/17）和9例(52.9%,9/17)；150枚淋巴结用常规病理组织学和CK20RT-PCR分别检出癌转移是19枚(12.7%,19/150)和45枚(30%,45/150)（χ²=24.4,P＜0.01)。常规病理组织学检查阴性的131 枚淋巴结中，CK20 RT-PCR检出微转移26枚(19.8%,26/131)。

　　2.大肠癌临床病理学和淋巴结转移情况：本组17例患者临床病理学与淋巴结转移情况见表1。

表1　17例大肠癌患者的临床病理学资料

注:B→C表示经RT-PCR检查Dukes分期从B期升为C期　　从表1可见，第9～11例CK20 RT-PCR检出了淋巴结的微转移，临床分期升级，因而当属Dukes C期；第14～17例CK20 rT-PCR 检出的淋巴结转移数目较常规病理组织学检查增多。

　　3.随访结果:全部病例术后中位随访时间为23.4个月（12～34个月）。11例Dukes b期患者中，3例淋巴结微转移阳性，其中1例（第10例，淋巴结微转移4/8）在术后25个月腹腔广泛转移死亡；8例淋巴结未查出微转移者随访时间内尚未发现复发或转移、无死亡。6例Dukes c期患者中，1例（第16例）于术后9个月死于左右叶多发肝转移，还有1例（第15例）在术后12个月发现复发，再次手术后5个月经RT-PCR检测有微转移。其他各例未见复发和转移迹象。

　　讨论

　　RT-PCR法具有病理组织学和免疫细胞化学技术不可比拟的敏感性，可以从10⁶～10⁷个正常组织细胞中检出一个肿瘤细胞^［6，7］，因而尤其适于微量肿瘤细胞的检测。我们以前建立的非同位素RT-PCR法，简便、快捷，避免了同位素使用的多种限制，更易被推广应用，从而保证了实验结果的可靠性。CK20具有严格的上皮分布特异性，非上皮来源组织或细胞如正常血液、骨髓和淋巴结不表达CK20。因此，CK20组织特异性强、满足高灵敏的RT-PCR法对靶RNA特殊要求，可作为大肠癌患者淋巴结中癌细胞存在的标志^［2］。

　　本组资料结果显示，CK20 RT-PCR法较常规病理组织学检查具有更高的敏感性，能鉴别常规病理组织学检查遗漏的淋巴结微转移（19.8%,26/131），显著提高了淋巴结微转移的检出率。11例组织学未发现淋巴结转移者，CK20 rT-PCR 法却检出其中3例存在淋巴结转移（27.3%,3/11），纠正了临床上对这3例肿瘤的盲目乐观分期（从Dukes b期到真正的Dukes C期），因而提高了大肠癌临床分期的准确性，对判断患者预后、指导术后辅助治疗均有重要的意义。临床对淋巴结常规组织学检查阴性，但进一步经CK20 rT-PCR检出有微转移者，不能再视为无淋巴结转移，应加强辅助治疗，注意密切的随访，尽早发现复发和转移，及时治疗。

　　本组资料中有4例（第14～17例）患者常规组织学检查发现有淋巴结转移，用CK20 rT-PCR检测比常规组织学检查多检出共15枚淋巴结（4枚→8枚,4枚→5枚，4枚→11枚,1枚→4枚）转移，预示这些患者预后可能更差，故治疗和随访更应积极。

　　本组病例的随访证实，Dukes B期患者中唯一死亡的1例是淋巴结有微转移者，淋巴结微转移数目最多。Dukes c期2例（1例复发、1例死亡）同样是经RT-PCR查出淋巴结转移较多者。表明大肠癌淋巴结微转移的检测结果与临床疾病行为和预后较为符合，是预测预后、指导治疗的重要指标。

　　作者单位：骆成玉（北京军区总医院普外科，100700）

　　李世拥（北京军区总医院普外科，100700）

　　赵丹宁（解放军第三Ｏ四医院外科）

　　邓永江（北京军区总医院病理科）

　　曲　军（北京医科大学人民医院外科）

　　祝学光（北京医科大学人民医院外科）

　　参考文献

　　［1］徐忠法，左文述，刘奇，主编.现代肛肠肿瘤外科学.山东:山东科学技术出版社,1993.96-101.

　　［2］Gunn J, McCall JL, Yun K, et al. Detection of micrometastasis in colorectal cancer patients by K19 and K20 reverse-transcription polymerase chain reaction.Lab Invest,1996,75:611-616.

　　［3］Deans GT, Parks TG, Rowlands BJ, et al.Prognostic factors in colorectal cancer.Br J Surg,1992,79:608-613.

　　［4］Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Br j Cancer,1995,71:278-281.

　　［5］骆成玉，李世拥.大肠癌患者外周血中癌细胞检测的临床意义.中华实验外科杂志，1999，16：199-200.

　　［6］Wong LS, Cantrill JE, Odogwu S, et al.Detection of circulating tumor cells and nodal metastasis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction technique.Br J Surg, 1997,84:834-839.

　　［7］房殿春,王东旭,罗元辉. 逆转录-聚合酶链反应技术检测肿瘤微转移.解放军医学杂志,1998,23:75-76.