增殖细胞核抗原在大肠癌中的表达意义

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 研究原著

作者：冯　树¹　宋今丹²　田秀荣³

单位：1中国科学院沈阳应用生态研究所微生物工程室　辽宁省沈阳市　110001;2中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室　辽宁省沈阳市　110001;3沈阳医学院细胞生物教研室　辽宁省沈阳市　110031

关键词：增殖细胞核抗原/代谢；结肠肿瘤/免疫学；直肠肿瘤/免疫学

Significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal carcinomas

　　fENG Shu¹, SONG Jin-Dan² and TIAN Xiu-Rong³¹Department of Microbial Engineering, Institute of Applied Ecology, chinese Academy of Sciences, Shenyang 110001, Liaoning Province, China²Key Laboratory of Cell Biology, Ministry of Public Health of China, china Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China³Division of Cell Biology, Shenyang Medical College, Shenyang 110031, liaoning Province, China

　　Subject headings　proliferating cell nuclear antigen/metabolism; colonic neoplasms/immunology; rectal neoplasms/immunologyAbstract

　　AIM　To study the significance of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in colorectal carcinoma tissues.

　　METHODS Using the monoclonal antibody to PCNA and S-P immunohistochemical method, the expression of PCNA in 63 cases of paraffin-embedded colorectal carcinoma tissues were semiquantitatively determined. Of the 63 patients, 23 had colon cancers, and 40 rectum carcinomas (33 men and 30 women, aged 26-76 years). The relationship between PCNA expression and tumor differentiation, invasion and lymph node metastasis in colorectal carcinomas were analyzed.

　　RESULTS The number of cases of PCNA positive grade Ⅰ-Ⅳ in well-, moderately-, and poorly-differentiated colorectal carcinoma groups were 12, 2,3,3;8,7,4,2; and5,3,6,8, respectively. The expression of PCNA in poorly-differentiated carcinomas was obviously higher than in well- and moderately-differentiated carcinomas (P＜0.05，P＜0.05), and it was independent of tumor invasion and lymph metastasis (P＞0.05，P＞0.05).

　　CONCLUSION The expression of PCNA can reflect the proliferating activities of colorectal carcinoma, and may be a useful index for studying the biological behavior of proliferation of colorectal carcinoma cells.

　　中国图书资料分类号　R735.34

　　摘　要目的　研究大肠癌组织中PCNA的表达意义.

　　方法　大肠癌组织63例，其中结肠癌23例，直肠癌40例；男33例，女30例；年龄26岁～76岁.用抗人PCNA单克隆抗体和S-P免疫组化技术半定量测定了PCNA在大肠癌组织中的表达，并分析了其与肿瘤分化、侵袭和淋巴结转移间的关系.

　　结果　高分化组PCNA阳性Ⅰ～Ⅳ级例数分别为12，2，3，3，中分化组为8，7，4，2，低分化组为5，3，6，8.经Radit统计学分析及显著性检验，低分化大肠癌中PCNA的表达显著高于高、中分化大肠癌(P＜0.05，P＜0.05)；其表达与肿瘤的侵袭和淋巴结转移无关(P＞0.05，P＞0.05).

　　结论　PCNA的表达可反映大肠癌细胞的增殖活性，是大肠癌增殖生物学行为的有用指标.

　　0　引言

　　增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一种细胞增殖标志物，Mr36 000D，是DNA多聚酶δ的辅酶，是DNA复制过程中所必需^［1］，在静止期细胞，其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2期、M期明显下降^［2］.因此，PCNA被作为一种很好的细胞增殖标记物用于肿瘤细胞的增殖动力学研究^［3，4］.有关大肠癌中PCNA的研究尚少. 本作者以S-P免疫组化技术半定量地观察了PCNA在63例大肠癌组织中的表达，以探讨其表达与大肠癌生物学特性间的关系.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　取中国医科大学第一临床学院病理科保存的大肠癌组织石蜡标本及外科手术切除大肠癌标本共63例，其中结肠癌23例，直肠癌40例；男33例，女30例；年龄26岁～76岁，平均57.6岁±11.3岁.大肠癌组织按肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期分组.所有标本均经100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，连续切5μm厚切片，供HE染色和免疫组织化学染色.

　　1.2　方法　采用过氧化酶标记的链霉卵白素(streptavidin-peroxidase, s-P)免疫组织化学方法. 主要试剂：S-P试剂盒及鼠抗人PCNA单克隆抗体为Zymed公司产品.主要步骤：①常规脱蜡至水化；②30mL/L过氧化氢(甲醇配制)中30min，封闭内源性过氧化物酶；③100mL/L正常羊血清37℃30min；④滴加Ⅰ抗，4℃过夜；⑤滴加生物素化羊抗鼠IgG(1∶150)，37℃30min；⑥滴加S-P复合物(1∶150)，37℃ 30min; ⑦0.5g/L DAB显色10min；⑧苏木素复染、脱水、透明、封片.其中1～3和4～6步骤后均经PBS洗3次，每次5min.每批染色均设阴性对照(以PBS置换一抗作阴性对照).光镜下观察结果. 每片观察5个高倍视野，统计阳性细胞数所占的百分数.按阳性细胞所占比例分为1～4级：Ⅰ：0%～25%；Ⅱ：26%～50%；Ⅲ：51%～75%；Ⅳ：76%～100%.

　　统计学处理　Radit统计分析及显著性检验.

　　2　结果

　　2.1　PCNA在大肠癌中的分布　PCNA为颗粒型或弥漫型综色阳性，定位于癌细胞核内，胞浆一般不着色.部分核分裂细胞显示整个细胞的阳性反应.在不同分化程度大肠癌组织或同一癌组织的不同区域，PCNA阳性的细胞数量和分布呈异质性.在癌周“正常”粘膜，PCNA主要表达在肠腺基底部的细胞核内，粘膜上皮细胞为阴性.

　　2.2　PCNA分级与大肠癌分化程度　高分化组PCNA阳性Ⅰ～Ⅳ级例数分别为12，2，3，3，中分化组为8，7，4，2，低分化组为5，3，6，8(表1).经Radit统计学分析及显著性检验，高分化及中分化组与低分化组比较均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.05).

　　表1　PCNA分级表达与大肠癌生物学特性间的关系

　　^aP＜0.05，vs 低分化组.

　　2.3　PCNA分级与大肠癌侵袭和转移　将大肠癌组织按浸润深度分为3组：粘膜层(包括粘膜下层)组、肌层组、浆膜层(包括浆膜下层)组；按有无局部淋巴结转移分为两组：转移组、无转移组；按临床Dukes分期分为3组：A，B，C.浸润至粘膜层组和肌层组PCNA阳性Ⅰ～Ⅳ级例数(2，1，1，0；16，2，8，7)与浸润至浆膜层组例数(7，9，4，6)经Radit统计分析无显著性差别(P＞0.05)；有淋巴结转移组PCNA阳性Ⅰ～Ⅳ级例数分别为19，5，10，8，无淋巴结转移组PCNA阳性Ⅰ～Ⅳ级例数分别为6，7，3，5，Radit统计分析也无显著性差异(P＞0.05，表1)； dukes A期，B期，C期3组间PCNA阳性表达结果亦无统计学意义.该结果表明，PCNA阳性半定量分级与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期无关.

　　3　讨论

　　肿瘤细胞的增殖活性是肿瘤学家十分关注的问题，因为细胞的增殖活性对于肿瘤的诊断和鉴别诊断、肿瘤的治疗和预防均有重要的参考意义.目前，判断肿瘤增殖活性的方法有：有丝分裂指数；³-H胸腺嘧啶核苷标计指数法；溴脱氧尿嘧啶标记(Brdu)法；核仁组织区嗜银蛋白(AgNOR)染色；Ki-67抗原免疫组化法；流式细胞术检测. pCNA免疫组化研究方法简单，阳性结果肯定，费时短，可对常规石蜡切片作回顾性研究，也可进行形态学评价. pCNA染色在肿瘤中的生物学意义，国外学者已通过对乳腺癌、前列腺癌、脑瘤、宫颈癌等病变的研究得出结论：①PCNA与肿瘤的分级有关，肿瘤的分级越高，PCNA的阳性率越高^［5,6］.②与癌的分期有关. ③与癌的愈后有关. 某些PCNA阳性率低的肿瘤患者存活时间较长，PCNA可作为患者愈后指标.对于PCNA表达在大肠癌中的生物学意义研究尚少，来茂德 et al^［7］曾比较研究了PCNA在正常大肠粘膜、结肠炎、腺瘤和腺癌中的表达，发现结肠炎和腺瘤及腺癌PCNA的阳性率较正常粘膜高.本研究结果显示，PCNA阳性半定量分级表达与癌的分化程度有关，低分化大肠癌PCNA表达显著高于高分化及中分化大肠癌(P＜0.05，P＜0.05).一般认为，肿瘤的恶性度与其分化程度有关，分化程度越低，其恶性程度越高，增殖活性越强.本研究结果即反映出肿瘤分化程度与细胞增殖活性的一般规律.但本研究中PCNA的表达与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移及Dukes分期无相关性.本结果提示：PCNA表达可以反映大肠癌细胞的增殖活性，可成为研究大肠癌增殖的生物学行为的良好指标.

　　本研究还发现，在同一癌组织中的不同区域，PCNA阳性强弱不均，这可能与癌组织的异质性有关.因为DNA的复制存在单个或多个起点，起点多者PCNA的量也多，其阳性反应也较强，即核的PCNA阳性程度可以反映DNA复制的活跃程度，故PCNA在大肠癌中表达的异质性提示大肠癌细胞生长调节失控，DNA合成紊乱.冯树，女，1965-02-09生，黑龙江省海林县人，汉族. 1986年佳木斯医学院临床医疗系毕业，1989、1996年分别获中国医科大学药理学硕士学位和细胞生物学博士学位，现为中科院沈阳应用生态所博士后.发表论文10篇.

　　通讯作者　冯树，110001，中国科学院沈阳应用生态研究所微生物工程室，沈阳市沈河区文化路72号.

　　Correspondence to: FENG Shu, institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, 72 Wenhualu, Shenhe district, Shenyang 110001, China

　　tel. +86*24*3916243收稿日期　1997-06-28　修回日期　1997-10-09

　　4　参考文献

　　1　Hall PA, levison DA. Review: Assessment of cell proliferation in histological materials. j Clin Pathol, 1990;43(1):184-192

　　2　Bravo R, Frank R, Blundell PA, macdonald-Bravo H. Cyclin/PCNA is the auxilliary protein of DNA polymerase-delta. nature(Lond), 1987;326(3):515-517

　　3　Hall PA, Levision DA, Woods AL, Yu C c-W, Kellock DB, Watkins JA et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections. J Pathol, 1990;162(2):285-294

　　4　Kawakita N, Seki S, Sakaguchi H, Yanai a, Kuroki T, Mizoguchi Y et al. Analysis of proliferating hepatocytes using a monoclonal antibody against porliferating cell nuclear antigen/cyclin in embedded tissues from various liver diseases fixed in formaldehyed. Am J Pathol,1992;140(2):531-520

　　5　Terada T, Nakanuma Y. Cell proliferative activiting in adenomatous hyperplasia of the liver and small hepatocellular carcinoma. An immunohistochemical study demonstrating proliferating cell nuclear antigen. Cancer, 1992;70(3):591-598

　　6　Eguchi A, Nakashima O, Okudaira S, sugihara S, Kojiro M. Adenomatous hyperplasia in the vicinity of smallhepatocellular carcinoma. Hepatology, 1992;15(4):843-848

　　7　来茂德，陈培辉. 大肠粘膜c-myc蛋白和增殖细胞核抗原表达的相关性研究.临床与实验病理学杂志，1994；10(1)：7-10